体细胞克隆的技术环节及影响因素职业教育医学生物技术专业教学

职业教育医学生物技术专业教学资源库体细胞克隆的技术环节及影响因素职业教育医学生物技术专业教学资源库0106目录0101020304克隆胚胎的构建方法克隆胚胎的激活克隆胚胎的体外培养克隆胚胎的胚胎移植职业教育医学生物技术专业教学资源库01克隆胚胎的构建方法职业教育医学生物技术专业教学资源库1.1供体（donor)细胞的获得

供体细胞的获得主要有2种途径。一条途径是直接从新鲜组织消化分离，不经过体外培养直接用于体细胞克隆。多用于卵丘细胞等易于分离的细胞。其优点是操作迅速、简便，细胞不易发生遗传变异；缺点是不能进行细胞周期同期化和基因的改造。职业教育医学生物技术专业教学资源库1.1供体（donor)细胞的获得

另一条途径是通过一定的方法建立体细胞的原代细胞系，经过体外培养后用于体细胞克隆。此种方法多用在成纤维细胞等易于体外培养的细胞。其优点是在体外培养过程中，可以进行基因改造并可以进行细胞周期的同期化处理，还可以获得很多遗传背景相同的克隆动物；缺点是体外培养可能影响克隆胚胎的重编程能力，从而影响克隆效率。职业教育医学生物技术专业教学资源库1.2细胞周期同期化处理

体细胞克隆是两个不同来源的细胞之间核质的重新组合的过程，因此，核质的协调是保证克隆效率的重要条件。细胞处于不同的细胞周期具有不同的细胞核结构和胞内蛋白组分。职业教育医学生物技术专业教学资源库1.2细胞周期同期化处理用于细胞核移植的供体细胞（核）有3大类：早期胎细胞、胚胎干细胞、胚胎成纤维细胞（严格来讲胚胎成纤维细胞也是体细胞）和体细胞，它们可来自活休或体外培养的细胞。移植前采用机械吹打或酶消化分散成单个细胞，培养、处理，使核供体细胞周期与受体细胞周期相协调和同步化，然后获取细胞核（可含少量细胞质）为供体。职业教育医学生物技术专业教学资源库1.3

核移植（nucleartransplantation)

利用显微操作技术将供体细胞移植到去核的卵母细胞并将细胞核融入到卵母细胞胞质中是体细胞克隆中最为精细的一步。此操作通常需要借助显微操作仪，对操作技能要求比较高。此操作通常有2种方法，即间接细胞融合法和直接注入法。职业教育医学生物技术专业教学资源库1.3.1

间接细胞融合法

间接细胞融合法就是将供体细胞注射到卵周隙中，通过细胞融合使供体细胞核进入到受体胞质中。该技术发源于20世纪70年代，最初是使用灭活的仙台病毒介导细胞质膜的融合，而后逐渐被毒性较低的聚乙烯乙二醇代替。与化学诱导膜融合同时发展起来的电融合技术是目前最为常用的方法。电融合效率高，操作简便，但其受到的影响因素很多，如温度、电脉冲参数、融合液的渗透压、离子种类和浓度等。职业教育医学生物技术专业教学资源库1.3.2

直接注入法

由于小鼠卵胞质膜较脆、抗电击能力差，而且小鼠体细胞较小，因此电融合率较低；再者，小鼠胚胎基因组激活发生在二细胞期，甚至在受精卵后期就开始表达，留给移入核的重编程时间短。因此Wakayama等利用Piezo驱动的注射装置，将小鼠的体细胞注射到卵母细胞质内重组胚胎，最终得到了克隆小鼠以及继代连续克隆小鼠50多只。职业教育医学生物技术专业教学资源库02克隆胚胎的激活职业教育医学生物技术专业教学资源库

克隆胚胎的激活是体细胞克隆技术的关键环节。体细胞克隆胚胎的充分激活是保证胚胎正常发育的先决条件，只有在去核卵母细胞充分激活的情况下才可以指导移入的核发生重编程。目前对克隆胚胎的激活方法有电激活、化学激活和电刺激结合化学激活。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.1电激活

电刺激可产生显著的跨膜Ca2+内流。一般认为短而高的直流电脉冲可导致真核生物质膜脂双层不稳定。这种可逆的不稳定使得质膜瞬间产生小孔洞，便于细胞内外离子和大分子的交换。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.1电激活

孔洞的大小受质膜电位变化、脉冲时程、培养液离子强度以及细胞类型等多个因素影响。在细胞外Ca2+存在时，电穿孔可在多种动物上诱导卵母细胞活化。如兔卵被刺激激活的效果取决于操作液中Ca2+的有无。这表明是Ca2+内流而非电刺激本身具有直接的激活作用。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.1电激活

根据在核移植前或核移植后进行激活而分为融合前激活、融合激活和融合后激活。

融合前激活，获得的卵母细胞是万能受体，即供体细胞不需要同期化，处于任何细胞周期的供体核移入该卵母细胞质中都有发育为成活个体的潜能。首例体细胞克隆山羊就是通过这种方案取得成功的。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.1电激活

融合同时激活和融合后激活是最常采用的激活方法，尤其是融合后激活法，可以使供体核与卵胞质充分的相互作用，有利于供体核的重编程。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.2化学激活

常用克隆胚胎的化学激活物质有乙醇、离子霉素、钙离子载体、放线菌酮和6-DMAP（6-二甲氨基嘌呤）。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.2化学激活

例如7%乙醇，把需激活的重组卵放入含7%乙醇的培养液中，在37℃、CO2培养箱中处理5min或室温下处理7min,洗净后进行培养。离子霉素(ionomycin),使用浓度为5mol/L,处理时间为4～5min；6-DMAP，使用浓度为1.9～2mmol/L,处理时间为3～5h或更长。职业教育医学生物技术专业教学资源库2.3电激活结合化学刺激

首先以电刺激激活重构胚胎，然后再放入含放线菌酮的培养液滴培养一段时间，进一步维持MPF（促成熟因子）活性处于低水平。为了减少重编程期间对供体核染色体的过度作用，放线菌酮的作用时间一般是3～5h,之后将克隆胚胎放入不含放线菌酮的相同培养液滴中培养。职业教育医学生物技术专业教学资源库

克隆胚胎的激活是哺乳动物体细胞克隆成功的关键环节之一。上述的激活方案中最为常用的是电刺激诱导融合，在融合的同时往往就完成了激活，而且电激活法比较简单，容易操作。但化学激活的应用使克隆的效率得到显著提高。职业教育医学生物技术专业教学资源库03克隆胚胎的体外培养职业教育医学生物技术专业教学资源库

与正常交配获得的胚胎相比，克隆胚胎染色体倍型的异常率高很多，核糖体RNA基因的活性以及许多蛋白质编码基因的表达异常。体外培养系统的缺陷也是导致胚胎吸收、死亡、流产、死胎或出生后死亡以及巨胎症的一个重要原因。

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体外培养主要是将克隆胚胎放到培养液内，置于CO₂培养箱中，在5%CO₂、95%空气（或5%CO₂、88%N₂、7%O₂、100%湿度）及37～39℃进行培养。使用的培养基有含血清或BSA(牛血清白蛋白)或者是无蛋白的化学限定培养基。职业教育医学生物技术专业教学资源库04克隆胚胎的胚胎移植职业教育医学生物技术专业教学资源库

克隆胚胎在体外培养发育至一定阶段就可以移植到同期发情处理过的代孕母体输卵管或子宫内进行后期发育。目前在大家畜如牛上，非手术法移植技术已经成熟，但对一些中小家畜如山羊、猪，目前多采用麻醉后