一案搞定PCR-2025年高考生物复习热点背练清单（解析版）

清单04PCR专题一次摘定PCR

面圆回国1

「岁匚二

5'1

9（TC以上变性，DNA双链解开

第“50。（:左右复性，引物与DNA结合

3'[

次《5'[

72（延伸，新DNA合成

循

3'[

环

15T

环

进行第三次循环变性、复性

第

次

循

环

L【PCR基因定点突变】重叠延伸PCR

MM而

“•汕.建1林w0网）

嬴限邓#四刚

JJ

zz®zz

K洒,钊b毡如一s’

例/.败川涉代I）程用物,

y2nlmnnT5S

A%

「uMJ*

T9"7"。彳

「卅一

riM

nr-

r^y

l^A5,冲

ntei

7V

有个地方不清楚可沿引物3引物43'端延伸

我直接拿手写这样方便大家熟悉这个过程，以免高考题出信息情境题，所以这个方法还是要了解一下流程。

2.（实时）荧光定量PCR技术

先从样本中提取RNA,RNA中可能有新冠病毒的RNA,同时也存在很多采样患者的组织和存在于采样部位的微生

物的RNA。通过逆转录酶将样本的RNA逆转录为cDNA,并进行PCR扩增，在PCR反应体系中，包含一对特异性引物

以及一个Taqman探针，该探针为一段特异性寡核昔酸序列，两端分别标记了报告荧光基团和淬灭荧光基团。探针

完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；若反应体系存在靶序列，PCR反应时探针与模板结合，DNA聚

合酶沿模板利用酶的外切酶活性将探针降解，报告基团与淬灭基团分离，发出荧光。每扩增一条DNA链，就有一个

荧光分子产生。荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数（Ct值）与病毒核酸浓度有关，病毒核酸

浓度越高，Ct值越小（如图）。

3.RT-PCR技术

如果想克隆一段已知mRNA序列的cDNA,可使用反转录酶PCR（reversetranscriptasePCR,RT-PCR）技术。

RT-PCR与刚才介绍的PCR技术的主要区别在于它是从mRNA而不是双链DNA开始的。先利用反向引物在反转录酶催

化下将mRNA反转录成单链DNA；DNA-RNA杂交链变性后，再用正向引物将单链DNA转换成双链DNA；接着在DNA聚

合酶催化下，正向引物起始cDNA第二链合成，将单链DNA转换成双链DNA；最后用常规PCR技术扩增足量的cDNA

用于克隆。

5'（反向

反“川用物）

（bileft：。正臼见的退火

小向明物|

sHMy

^■■■■^_）

归）DNA*fHW

理］因凰氏］

一、单选题

1.（24-25高三上•天津•阶段练习）某种二倍体植物的Pi和P2植株杂交得Fi,Fi自交得F?。对不同个体的DNA

进行PCR检测，产物的电泳结果如图所示，其中①〜⑧为部分F?个体，上部两条带是一对等位基因的扩增产物，下

部两条带是另一对等位基因的扩增产物，这两对等位基因位于非同源染色体上。下列相关叙述错误的是（）

ppFF

r1121___________________1____________

①②③④⑤⑥⑦⑧

电源负极

电源正极

A.①②个体均为杂合体，F,中③所占比例大于⑤

B.还有一种握个体的PCR产物电泳结果有三条带

C.①自交子代的PCR产物电泳结果有1/2与④电泳结果相同

D.③和⑦杂交子代的PCR产物电泳结果与②⑧电泳结果相同

【答案】C

【分析】基因自由组合定律的实质是：位于非同源染色体上的非等位基因的分离或自由组合是互不干扰的；在减数

分裂过程中，同源染色体上的等位基因彼此分离的同时，非同源染色体上的非等位基因自由组合。

【详解】A、由题可知，这2对等位基因位于非同源染色体上，假设A、a分别为上部两条带的等位基因，B、b分别

为下部两条带的等位基因，由电泳图可知Pi为AAbb,P2为aaBB,F,为AaBb,F2中①基因型为AaBB,②基因型为Aabb,

都为杂合子，握中③基因型为AABb,占F2的比例为2/16,⑤基因型为AABB,占F2的比例为1/16,故F?中③所占比

例大于⑤，A正确；

B、由电泳图可知，F?中①〜⑧基因型依次为：AaBB、Aabb、AABb、aaBB、AABB、AAbb、aabb、AaBb,未出现的基

因型为aaBb,其个体PCR产物电泳结果有三条带，B正确；

C、由电泳图可知，①基因型为AaBB,自交子代为AABB（占比为1/4）、AaBB（占比为2/4）、aaBB（占比为1/4）,

因此①自交子代的PCR产物电泳结果有1/4与④（aaBB）电泳结果相同，C错误。

D、由电泳图可知，③基因型为AABb和⑦基因型为aabb,杂交后代为Aabb、AaBb,其PCR产物电泳结果与②（Aabb）、

⑧（AaBb）电泳结果相同，D正确；

故选Co

2.（24-25高三上•湖北•期中）图1是某单基因遗传病的遗传系谱图，该病在人群中的发病率为1/8100。科研

人员提取了四名女性的DNA,用PCR扩增了与此病相关的基因片段，并对产物酶切后进行电泳（正常基因含有一个

限制酶切位点，突变基因增加了一个酶切位点），结果如图2。相关叙述正确的是（）

bpI-1n-3n-5

□正常男性

o正常女性

■•患者

A.该病的遗传方式可能为伴X染色体隐性遗传

B.II-1与II-2婚配生一个患病男孩的概率为1/91

C.该突变基因新增的酶切位点可能位于310bp或118bp中

D.扩增II-2与此病相关的基因片段，酶切后电泳将产生3种条带

【答案】D

【分析】分析图1，IT和I-2表现正常，但生下了II-2的患病女性,所以该病是常染色体隐性遗传病，用A/a

表示控制该病的基因，所以，1-1和1-2基因型是人2。从图2中可以看出，11-3、II-4和1-2电泳图相同，所以

基因型都是Aa,II-5与他们不同，但表现正常，基因型是AA。

【详解】A、1-1和1-2表现正常，但生下了II-2的患病女性，所以该病是常染色体隐性遗传病，A错误；

B、该病在人群中的患病率为1/8100,则致病基因频率为1/90,正常基因频率为89/90,根据基因平衡定律，II-1

表现正常，基因型为Aa的概率=Aa/（AA+Aa）=（2XA基因频率Xa基因频率）/（A基因频率XA基因频率+2XA基因

频率Xa基因频率)=(2X1/90X89/90)/(1/90X1/90+2X1/90X89/90)=2/91,其与II-2Aa婚配生一个患病男孩

的概率为2/91X1/4=1/182,B错误;

C、结合图2可知，正常基因酶切后可形成长度为310bp和H8bp的两种DNA片段，而基因突变酶切后可形成长度

为217bp、93bp和118bp的三种DNA片段，这说明突变基因新增的酶切位点位于长度为310bp（217+93）的DNA片

段中，C错误；

D、基因突变酶切后可形成长度为217bp、93bp和H8bp的三种DNA片段，H-2基因型是aa,只含有突变基因，所

以酶切后电泳将产生三种条带，D正确。

故选Do

3.（23-24高三上•浙江•阶段练习）实时荧光定量逆转录PCR（qRT-PCR）是指先逆转录得到DNA,然后进行PCR

扩增。加入的Taqman荧光探针与模板DNA的某条链互补结合，每复制一次，就有一个荧光分子生成，当荧光强度

达到一定程度就可以被仪器检测到，原理如图所示。下列叙述错误的是（）

（注：Ct值是指PCR扩增过程中，缓冲液中的荧光强度首次超过设定阈值时，PCR反应所需的循环数。）

A.图中的TaqDNA聚合酶具有5'外切酶活性

B.荧光报告基团连接在Taqman探针的5'端

C.该PCR过程只需要加入1种足量的引物

D.Ct值越小，说明体系中目标RNA越多

【答案】C

【分析】实时荧光定量PCR技术中，TaqDNA聚合酶有两个作用，一是形成子链的磷酸二酯键，二是水解探针，破坏

磷酸二酯键；破坏探针导致荧光出现。

【详解】A、在该反应中TaqDNA聚合酶有两个作用，一是形成子链的磷酸二酯键，二是水解探针，破坏磷酸二酯键，

R端是5'端，TaqDNA聚合酶具有5'外切酶活性，A正确；

B、因为引物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始连接脱氧核甘酸，从图中引物的方向可以分析出，荧光

报告基团连接在Taqman探针的5'端，B正确；

C、该PCR过程需要加入2种引物，C错误；

D、Ct值越小，达到荧光阈值所经历的循环次数越少，说明体系中目标RNA越多，D正确。

故选Co

4.（22-23高三下•河南焦作•阶段练习）RT-PCR是将RNA逆转录（RT）成cDNA（与mRNA互补的DNA单链）和聚

合酶链式反应（PCR）相结合的技术，具体过程如图所示，下列叙述正确的是（）

A.过程I获得cDNA的过程与DNA复制过程中存在的碱基配对方式相同

B.图中A、B两种引物的核甘酸序列不同，但参与子链合成的酶均相同

C.图中子链的合成均是以四种核糖核甘酸为原料从引物的一端开始的

D.过程II中，若进行6轮循环，则共需要加入引物的数量为63个

【答案】D

【分析】PCR技术是聚合酶链式反应的简称，利用DNA复制的原理，RT-PCR需要先完成逆转录过程再进行DNA复制，

逆转录和DNA复制都遵循碱基互补配对原则。

【详解】ABC、过程I是以四种脱氧核糖核甘酸为原料，以mRNA为模板逆转录合成DNA的过程，催化该过程的酶是

逆转录酶，存在的碱基配对方式是U—A、A—T、C—G、G-C；过程H是DNA单链复制过程，是以四种脱氧核糖核昔

酸为原料，以DNA单链为模板合成DNA单链的过程，催化该过程的酶为TaqDNA聚合酶，该过程中存在的碱基配对

方式是A—T、G—C,ABC错误；

D、过程H中，若进行6轮循环，最终产生的DNA单链数为26=64（条），新合成的子链数为63条，则进行6轮循环，

共需要加入引物的数量为63个，D正确。

故选Do

二、多选题

5.（24-25高三上•湖北•阶段练习）某科研小组利用PCR定点突变技术培育抗冻番茄新品种。设计含有非特异性

碱基配对的引物，将突变位点引入编码抗冻蛋白的基因中，获得抗冻能力更强的突变基因。下列叙述正确的是（）

拟突变位点

遍，/艮5'3幽,

3浅9---------3'5'-------------A------------3'

—T-------------5'3'-------------T-------------5'

5'-----3,

引物11②弓।物斗③

f3'5。3'

3人5'

出除变性后，杂交

5'-

3ys-------------5’

（⑤

5'-_____A________a，

3人--------A-------------5-

突变后的基因

注:引物突起处代表与模板链不能互补的突变位点。

A.过程②还需要四种脱氧核甘酸和耐高温的DNA连接酶

B.过程③至少需要进行2次循环才能得到两条链等长的DNA分子

C.过程④获得的2种杂交DNA中只有一种经过程⑤能获得目的基因

D.常采用显微注射法将获得的目的基因导入番茄细胞培育抗冻新品种

【答案】BC

【分析】PCR全称为聚合酶链式反应，是一项在生物体外复制特定DNA的核酸合成技术。原理：DNA复制。前提条

件：要有一段已知目的基因的核甘酸序以便合成一对引物。过程：①高温变性：DNA解旋过程；②低温复性：引物

结合到互补链DNA上；③中温延伸：合成子链。PCR扩增中双链DNA解开不需要解旋酶，高温条件下氢键可自动解

开。

【详解】A、PCR过程需要的是四种脱氧核昔酸和耐高温的DNA聚合酶，A错误；

B、过程③扩增一次得到的是长链和短链，第二次扩增才能得到两条等长的短链，B正确；

C、根据引物的延伸方向是5'-3'方向，且过程④是利用已有的模板作引物，因此过程④获得的2种杂交DNA中

只有一种经过程⑤能获得目的基因，C正确；

D、将目的基因导入动物细胞常用显微注射法，而将目的基因导入植物细胞采用农杆菌转化法或花粉管通道法，D

错误。

故选BC=

三、非选择题

6.（2024•广东深圳•模拟预测）胶原蛋白在维持器官、组织、细胞等方面发挥着关键性作用。科学家将合成胶

原蛋白的基因kit导入大肠杆菌构建基因工程菌，过程如下图所示。请据图回答下列问题：

（1）若导入到原核生物大肠杆菌中，但由于原核细胞中缺少（细胞器），影响表达产物进一步加工，可能会影

响蛋白质的功能。

（2）已知kit基因的部分序列如下图，采用PCR技术进行扩增时，选用的引物为（填字母）。为使基因与质粒

成功连接，需要在引物的端添加两种限制酶识别序列。

-5-CGGGATCCA...................................AGAATTCCG-3'

3-GCCCTAGGT.....................................TCTTA_4GGC-5'

A.5'-GCCCTAGGT-3，B.5'—CGGAATTCT-3)

C.5'-CGGGATCCA-3，D.5'—GCCTTAAGA-3'

(3)酶切kit基因，并与质粒中长度为170bp片段进行置换，构建重组质粒pET-28a(+)-kit,用HindIII酶分

别酶切pET-28a(+)和pET-28a(+)-kit,获得如下表所示片段，

质粒类型pET—28a(+)pET—28a(+)—kit

Hindlll酶切片段lOOObp、2550bp1000bp>2000bp>700bp

则kit基因长度为,由此判定kit基因上有个Hindlll酶切位点。

(4)菌液PCR是直接以菌体热解后的DNA为模板、以目的基因两端序列为引物进行扩增的方法，PCR产物需要用一

法进行鉴定，若结果出现大量杂带，其原因可能有。(答出两点)

【答案】(1)内质网、高尔基体

(2)BC5'BamHI和EcoRI

(3)320bp2

(4)琼脂糖凝胶电泳模板受到污染；引物的特异性不强；复性温度偏低。

【分析】限制酶能够识别双链DNA分子的特定核甘酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开。选择合

适的限制酶对目的基因和质粒进行切割的原则：①不能破坏目的基因；②不能破坏所有的抗性基因(至少保留一个)；

③最好选择两种限制酶分别切割质粒和目的基因，防止目的基因和质粒反向连接，同时要防止目的基因自身环化和

质粒的自身环化。

【详解】(1)若导入到原核生物大肠杆菌中，由于原核细胞中缺少内质网、高尔基体等细胞器，这些细胞器在真

核细胞中负责蛋白质的进一步加工和修饰，因此原核细胞表达的蛋白质可能会缺少某些加工步骤，从而影响蛋白质

的功能。

(2)在PCR中，引物与模板链的3'端碱基互补配对，并且引物的方向与模板链走向相反，因此与图中kit基因上

面一条链结合的引物，其序列应为5'-CGGAATTCT-3',与kit基因下面一条链结合的引物其序列应为5'

-CGGGATCCA-3,,综上所述，AD错误，BC正确；由于。ri复制原点中含有限制酶Hindlll的识别序列，因此不能用限

制酶Hindlll来切割质粒，否则会破坏复制原点，只能用限制酶BamHI和EcoRI对质粒pET-28a(+)进行双酶切，这

样可以防止目的基因与质粒的自身环化以及任意连接；同时要在kit基因两端也连上限制酶BamHI和EcoRI的识

别序列，由于DNA聚合酶只能从引物的31端连接脱氧核甘酸延伸子链，因此必须将限制酶BamHI和EcoRI的识别

序列连接至引物的5'端。

(3)观察质粒pET-28a(+)图可知，在该质粒上有两个Hindlll的识别序列，一个在启动子和终止子之间，一个在

复制原点ori中，因此用Hindlll切割质粒pET-28a(+)后，可得到两个片段，通过表格可知，这两个片段长度分别

为lOOObp和2550bp,说明质粒pET-28a(+)总长度是1000bp+2550bp=3550bp；利用双酶切法将kit基因与质粒

pET-28a(+)长度为170bp片段进行置换后，形成的重组质粒pET-28a(+)-kit能被Hindlll切割成三个片段，长

度分别是lOOObp、2000bp,700bp,说明置换后的kit基因上含有两个Hindlll的识别序列，再加上复制原点ori

中的一个Hindlll的识别序列，共三个Hindlll的识别序列，经Hindlll酶切后才能将重组质粒pET-28a(+)-kit切

成3段。利用这三段的长度可计算出重组质粒pET-28a(+)-kit的总长度为1000bp+2000bp+700bp=3700bp,由于

kit基因与长度为170bp片段进行置换，设kit基因长度为n,可列出等式：3550+n-170=3700bp,故可计算出kit

基因长度为n=320bp。

(4)PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定。若结果出现大量杂带即获得的产物有非目的DNA序列，原因可能

是：模板受到污染，里面混有其他DNA；引物的特异性不强，与非目的序列结合；复性温度偏低，导致引物特异性

降低；Mg?"浓度过高，导致PCR特异性不强等。

7.(24-25高三上•天津滨海新•阶段练习)四尾栅藻是一种淡水藻类，繁殖快、适应性强，可作为制备生物柴油

的重要原料之一。为提高四尾栅藻油脂含量，研究人员将从含油量高的紫苏中获得的二酰甘油酰基转移酶基因

(DGAT1)与pBH21质粒构建表达载体，经转化成功获得高产油脂四尾栅藻，主要研究过程如下图，其中DGAT1-F

(5'—GCATCTAGAATGGCGATCTTGGACTC-3')和DGATl-RC5Z-CGGATCCCTACCTTGCACTAGCTTTTC-)

是以DGAT1基因为依据设计的一对引物，lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落

呈现蓝色，否则菌落呈现白色。请回答下列问题。

①DGAT1

紫苏总RNA—卡那霉素启动子

RT-PCR抗性基因

DGAT1-F"PBI121

DGAT1-R载体终止子

复制原点(4349bp)力转换DGAT1(14756bp)

箍选大肠杆菌I复制原点

氨节青霉素

抗性基因④

限制牌识别序列及切割位点

转化

Z表达

BamHI5,GfGATCC3四尾栅藻—-载体

SacI5'GAGCTfC3'

Xbal5'TlCTAGA3'

EcoRI5'GfAATTC3'

(1)过程①中需要的酶有和,过程②应选用的限制酶是和

(2)在保存DGAT1基因时，将克隆载体导入大肠杆菌的优点有(多选)。

①稳定保存②准确复制③快速表达④方便取用

(3)过程③经转化的大肠杆菌通过(方法)接种到培养基上继续培养。为筛选获得目标菌株，培养基应加入

的成分有。

(4)为检测表达载体转化四尾栅藻的情况及确定目的基因是否表达，研究人员进行了如下实验，请完成下表。

实验步骤简要操作过程

经转化后的四尾栅藻接种于含①_____的BGH固体培养基并放置于人工气候箱培养，一段时间后观

初筛培养

察其生长情况

扩大培养在BG11固体培养基上分别挑取数个单藻落接种至BG11液体培养基中光照摇床培养，编号备用

收集四尾栅藻藻体，提取基因组DNA,以DGAT1-F和DGAT1-R为引物，进行PCR验证，未转化的四尾

PCR验证

栅藻作对照

油脂含量测

利用索氏抽提法，分别测定②_____的油脂含量

定

结果处理统计并比较PCR验证结果及藻体中油脂的含量

【答案】(1)逆转录酶耐高温的DNA聚合酶BamHIXbaI

⑵①②④

(3)稀释涂布平板法氨苇青霉素、X-gal>IPTG

(4)卡那霉素(等量的)转化后和未转化的四尾栅藻

【分析】1、基因工程的基本工具：限制性内切核酸酶，识别双链DNA分子的特定核昔酸序列，并且使每一条链中

特定部位的磷酸二酯键断开。DNA连接酶，将两个DNA片段连接起来，恢复被限制酶切开的磷酸二酯键。载体，将

外源基因送入受体细胞。

2、基因工程的基本过程：目的基因的筛选与获取，基因表达载体的构建，将目的基因导入受体细胞，目的基因的

检测和鉴定。

【详解】(1)过程①包括逆转录和PCR,逆转录需要逆转录酶的参与，PCR过程需要耐高温的DNA聚合酶；限制酶

的作用是识别双链DNA分子的特定核昔酸序列，并且使每一条链中特定部位的磷酸二酯键断开，对比几种限制酶的

结合位点和DGAT1-F、DGAT1-R的碱基序列，可知过程②应选用的限制酶是BamHI（切割DGAT1-R所在序列）和Xba

I（切割DGAT1-F所在序列）。

（2）将克隆载体导入大肠杆菌，可以与外界环境隔离，能够稳定保存，准确复制，大肠杆菌比基因方便取用，故

选①②④。

（3）根据培养基上菌落的分布（各菌落分散分布）可知所用接种方法是稀释涂布平板法；克隆载体中含有氨茉青

霉素抗性基因、lacZ基因，氨革青霉素抗性基因用于筛选成功导入质粒（含目的基因的重组质粒和不含目的基因的

空白质粒），由图可知，经过程②质粒上的LacZ基因被目的基因破坏，故LacZ基因可用于筛选导入含目的基因的

重组质粒，lacZ基因编码产物在X-gal和IPTG存在下，可以产生蓝色沉淀，使菌落呈现蓝色，否则菌落呈现白色，

所以为筛选获得目标菌株，培养基应加入的成分有氨革青霉素、X-gal、IPTGo

（4）PBI121质粒中含有卡那霉素抗性基因，所以经转化后的四尾栅藻接种于含卡那霉素的BG11固体培养基并放置

于人工气候箱培养，一段时间后观察其生长情况；上一步骤中用未转化的四尾栅藻作对照，所以利用索氏抽提法分

别测定（等量的）转化后和未转化的四尾栅藻的油脂含量，从而检测表达载体转化四尾栅藻的情况及确定目的基因

是否表达。

8.（24-25高三上•江西赣州•阶段练习）番茄不耐寒，冬季容易冻坏，难以储藏。我国科研人员从某植物中提取

了种抗冻基因AtC0R15a,经过•系列过程获得转基因抗冻的番茄新品种，操作流程如图。回答下列问题：

质粒

（1）用PCR技术扩增AtCORl5a基因时需要添加引物，引物的作用是。

（2）如果要将AtC0R15a基因与质粒构建重组DNA分子，一般采用双酶切法，据图分析选用的两种限制酶组合

是.0

（3）图中是采用法将目的基因转移到番茄细胞中，并将其整合到该细胞的上。

（4）为了提高AtC0R15a基因的表达能力，可将AtCORl5a基因与外源强启动子连接，如下图所示。

①一②一

-------1强启动子------1AtC0RI5建因-------（注：图中①、②、③、④表示引物）

利用PCR检测上述连接是否正确，可选择的引物组合是（填字母），该PCR反应体系中需加入—

酶。

A.①+②B.①+③C.②+③D.③+④

【答案】（1）使DNA聚合酶能够从引物的3,端开始复制

⑵HindIII和BamHI

（3）农杆菌转化法染色体DNA

（4）BTaqDNA聚合（耐高温DNA聚合）

【分析】基因工程的基本操作程序：第一步：目的基因的获取；第二步：基因表达载体的构建（核心）；第三步:

将目的基因导入受体细胞1、转化的概念：是目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程；

第四步：目的基因的检测和表达。

【详解】（1）用PCR技术扩增AtCORl5a基因时需要添加引物，引物是根据已知一段目的基因的核甘酸序列设计

的，其能与目的基因两端的碱基序列实现互补配对，进而使PCR扩增过程中子链的延伸发生在引物的3'端，即引

物的作用是使DNA聚合酶能够从引物的3'端开始复制。

(2)为了能筛选重组DNA分子，必须保留抗生素抗性基因，不能选择Smal,若选择EcoRI,则目的基因两端具

有相同的黏性末端，目的基因会自身环化，综上分析，采用双酶切法，据图分析选用的两种限制酶组合是HindIII

和BamHI»

(3)将目的基因转移到植物细胞常使用农杆菌转化法，即当②农杆菌侵染番茄细胞后，利用农杆菌转化法将目的

基因转移到番茄细胞中，并且将其整合到受体细胞的染色体DNA上。

(4)为了提高AtC0R15a基因的表达能力，可将AtC0R15a基因与外源强启动子连接，如图示，在利用PCR检

测连接是否成功，应当将强启动子和AtC0R15a基因都扩增出来，所以可选择的引物组合是①+③。故选Bo该PCR反

应体系中需加入TaqDNA聚合(耐高温DNA聚合)酶，以此来扩增DNA。

9.(22-23高二下•江苏扬州•阶段练习)引起新冠肺炎的新冠病毒是一种带包膜的RNA病毒，包膜表面有与人体

细胞膜表面的ACE2受体结合的S蛋白。疫苗接种和病毒检测是当前新冠肺炎疫情防控工作的重要举措。请回答下

列问题：

I、疫苗的研发和接种

(1)灭活疫苗。工业生产上利用Vero细胞能无限增殖的特性培养新冠病毒，可实现的目的。

(2)腺病毒载体疫苗。该疫苗主要成分是活的、有复制缺陷、能表达S蛋白的重组人5型腺病毒。这种方式生产的

疫苗由于重组腺病毒,从而提高了疫苗的安全性。

(3)重组亚单位疫苗。其技术线路是：提取新冠病毒RNA-通过RT酶PCR(反转录酶聚合酶链式反应)技术扩增筛

选RBD蛋白(S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分)基因一构建基因表达载体一导入CH0细胞并培养一提取并纯化

RBD蛋白一制成疫苗。利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因时，需加入酶；扩增RBD蛋白基因时，应选择的

引物为。PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准(Marker),2号泳道是以为材料做的

阳性对照组，3号泳道为实验组。图3中3号泳道出现杂带，原因一般有(至少答出两点)。基因表达载体构

建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图1中选择的限制酶是。

123

EcoRISmaIEcoRI

［弓建2标记基因BamHIHindDIEcoRI

引物1引物斗引物4

5'3'

■4引物6引物71引物8图2运载体片段示意图

、

BamHIRBD蛋ZZWY基因~'HindID

图1RBD蛋白基因结构与引物位置示意图

图3

II、新冠病毒的检测

(4)核酸检测

图4是我国自主设计的新冠病毒核酸检测平台示意图，图5为RT-PCR(实时荧光逆转录聚合酶链式反应)示意图。

当探针完整时，荧光基团(R)发出的荧光信号被淬灭基团(Q)吸收而不发荧光；当Taq酶遇到探针时会使探针水

解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步。

病毒样品RNA

Ia的困§@Q

洋大+病毒・样本信♦自动化+自动%+自动WR.RTP「R双链DNA=

样本.灭活十息录入*分装♦核酸提取+体系配置.RT-PCR

引物、探针与模板链结合TaqMan探针

引物1

施

全自动分杯全自动核酸自动化液体

处理系统提取纯化仪处理系统新链延伸遇到探针

I，I

Taq酶切割探针

L样放荧光

醉\

实验室信息管理系统仪器检测

力蝙I荷一

图4新链聚合完成

图5

①在自动化PCR体系配置中加入引物和探针，引物和探针与模板结合发生在PCR循环中的阶段。

②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TaqMan探针，设置R发出的荧光信号的

值为L若经n次的PCR扩增，实时荧光信号强度(填“增强”“减弱”或“不变”)，说明样液中病毒的核

酸数量为0；

(5)抗原和抗体检测：为了及早发现新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测

的有效补充措施。对于已注射过灭活疫苗的人员，应选择(填字母)检测。

a、核酸检测b、抗原检测c、抗体检测

【答案】(1)获得大量新冠病毒，降低生产成本

(2)无法在人体宿主细胞内复制(增殖)

(3)逆转录酶、Taq酶引物4、引物5(提纯的)RBD蛋白基因片段模板受到污染；引物的特

异性不强；退火温度偏低BamHI和HindIII

(4)复性(或退火)不变

(5)ab

【分析】常见的疫苗种类有：

(1)灭活疫苗，首先灭活病毒，使其失去传染性和致病性，但保留了病毒完整结构，具有能够让免疫系统识别的

抗原性。

(2)腺病毒载体疫苗是选择一种对人体无害的，不致病的腺病毒作为载体，利用基因工程技术将病毒基因经过一

定的安全处理，使其成为一种只能对人体有一个细胞周期侵染能力的复制缺陷性病毒，然后将新冠病毒侵入人体的

关键基因植入到这种复制缺陷的腺病毒基因中，利用这种技术制成疫苗，可使新冠病毒的抗原搭载腺病毒之船进入

人体，因此这类疫苗被称为腺病毒载体疫苗。

(3)重组亚单位疫苗通过各种方式培养病毒抗原蛋白，将特异性抗原的基因插入易于增殖的病毒或细胞，以表达

有效特异性抗原，经纯化后制备的疫苗。在研发过程中会使用到RT-PCR技术，将RNA的反转录(RT)和cDNA的聚

合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。首先经反转录酶的作用，从RNA合成cDNA,再以cDNA为模板，在DNA聚合酶

作用下扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平、细胞中RNA病毒的含

量和直接克隆特定基因的cDNA序列。

【详解】(1)vero细胞是指非洲绿猴肾细胞，可用于检查大肠杆菌毒素，作为培养病毒的细胞宿主和真核寄生虫

的宿主细胞。之所以选择vero细胞生产病毒，是因为它容易培养，传播稳定，可以无限分裂，所以vero细胞用于

生产许多疫苗。如工业生产上利用Ver。细胞能无限增殖特性培养新冠病毒，可实现获得大量新冠病毒，降低生产

成本。

(2)腺病毒载体疫苗，是利用基因工程技术，把致病病毒的关键基因片段植入到改造后的无害病毒中，重组成疫

苗。这个疫苗和无害病毒B一样不致病，却拥有致病病毒的长相，能使免疫系统认识致病病毒，并产生免疫记忆，

从而阻断致病病毒的入侵。在疫苗研发中，改造后的腺病毒不能在体内复制，也无法整合进宿主细胞基因组中，所

以，从理论性上来讲，对人体不会造成危害。

（3）RT-PCR技术是将RNA的反转录和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。重组亚单位疫苗的技术线路

是：提取新冠病毒RNA一利用RT酶PCR技术扩增筛选RBD蛋白（S蛋白中真正与ACE2结合的关键部分）基因一构

建基因表达载体一导入CHO细胞并培养一提取并纯化RBD蛋白一制成疫苗。利用RT酶PCR技术，获取S蛋白基因

时，需加入逆转录酶、Taq酶。扩增RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物4、引物5,因为通过这两种引物能扩增

出带有限制酶序列的目的基因。PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下：1号泳道为标准（Marker）,2号泳道是以

RBD蛋白基因片段为材料做的阳性对照组，3号泳道为实验组。PCR技术受到温度，酶，所用蛋白材料等因素的影响，

因此，图3中3号泳带出现杂带原因可能是引物的特异性不强，结合到模板的其他地方；模板不纯受到污染，结合

到其他模板；目的片段与引物有多处结合；退火温度偏低等。根据图1可以分析出基因表达载体构建中为提高目的

基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图1中选择的限制酶是BamHI和HindIII。

（4）①PCR原理是体外DNA复制，其过程包括变性、复性和延伸，复性指的是引物与模板链之间形成氢键的过程；

加入自动化PCR体系配置中的引物和探针的设计依据是新冠病毒的基因对应的部分核甘酸序列。引物和探针与模板

结合发生在PCR循环中的复性（或退火）阶段。

②利用荧光定量PCR仪可监测待测样液中病毒的核酸数量。若每断裂一个TaqMan探针，设置R发出的荧光信号的

值为1,可见荧光强度与核算数量相对应，则经n次的PCR扩增，样液中病毒的核酸数量为0,则说明实时荧光信

号强度不变。

（5）为了及早发现新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测的有效补充措施。

这两种试剂盒的检测原理为抗原抗体的特异性结合，即抗原-抗体杂交。对于已注射过灭活疫苗的人员，由于其体

内发生了相应的特异性免疫反应。因而体内含有较多的抗体，因此，应选择核酸检测和抗原检测。

10.（22-23高三上•江苏扬州•阶段练习）科研人员发现在人类肿瘤细胞中LMNA基因表达异常，LMNA基因编码

的核纤层蛋白与维持细胞核的正常形态有关。科研人员利用CRISPR/Cas9技术对体外培养的HepG2（人源肺癌细胞）

细胞株进行基因编辑，获得了LMNA基因敲除的稳定细胞系。

（l）Cas9是一种核酸内切酶，它与sgRNA（向导RNA）构成的复合体能与DNA分子特定碱基序列结合，如图1。作用

时sgRNA与DNA单链进行碱基互补配对，然后Cas9催化水解，从而使DNA在PAM序列（几乎存在于所有

基因中）的（填“上游”或“下游”）被切断。

TCas9

.3Z一

口5,―fsgRNA

NGGPAM序列

（N表示任意碱基）

JEE基因组DNA

ACasM〃&

图1

⑵一般来说，在使用CRISPR/Cas9系统对不同基因进行编辑时，应使用Cas9和（填“相同”或“不同”）

的sgRNA结合构成复合体进行相关基因的编辑，其中Cas9对DNA的切割（填“具有”或“不具有”）

类似于限制酶的“限制性”。

（3）HepG2细胞中没有编码Cas9的基因，需将Cas9基因及sgRNA基因拼接形成拼接基因并与质粒结合导入HepG2

细胞，sgRNA的合成需要酶的催化。

⑷用图2中的质粒以及含Cas9-sgRNA拼接基因的DNA片段构建表达载体时，应选用进行酶切。将构建好的表

达载体与用处理的细菌置于适宜反应体系中培养。然后将培养的细菌涂布于含的平板培养

基上，37℃培养，24h后挑取菌落，提取质粒作为模板，选择图3中引物组合和,通过PCR和电

泳技术鉴定是否重组成功。

拼接基因插入位置

II

5'-“CCGTGT”.~^~.“ATGCCT…-3'5-...GGGATG-3'

3GGCACA--H--TACGGA"-5'3'—"CCCTAG--5'

I_______________™______________III

插入部位两端拼接基因

i-I5'-…GATCCC…-3'

EcoRIEcoRIBamHI

*W3种引物-115'—'AGGCAT•“-3'

■III5'--CCGTGT--3'

Cas9-sgRNA拼接基因

图3

图2

（5）用鉴定成功的工程菌对HepG2细胞进行转染，培养三天后收集HepG2细胞，从分子水平和细胞水平检测导入是

否成功。

①提取HepG2细胞的基因组，对DNA分子的序列进行检测。

②请写出细胞水平的一项检测指标：o

【答案】（1）磷酸二酯键上游

（2）不同不具有

（3）RNA聚合酶

2+

（4）EcoRICa（CaCl2）喋吟霉素I皿（两空位置可调换）

（5）碱基（或核甘酸）HepG2细胞的细胞核形态或单位时间内细胞数目的增长量等

【分析】1、基因工程的工具：（1）限制酶：能够识别双链DNA分子的某种特定核甘酸序列，并且使每一条链中特

定部位的两个核甘酸之间的磷酸二酯键断裂。（2）DNA连接酶：连接的是两个核昔酸之间的磷酸二酯键。（3）运

载体：常用的运载体：质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。

2、基因工程的基本操作程序包括：目的基因的筛选与获取、基因表达载体的构建、将目的基因导人受体细胞、目

的基因的检测与鉴定。通常利用PCR获取和扩增目的基因。在构建基因表达载体时，首先会用一