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文档简介

第二章生物制药工艺技术基础第一节生化制药工艺技术基础由人体组织起源生化药品含有疗效好,几乎无副作用独特优点。但因为以人体组织提供原料受到法律或伦理方面严格限制,所以有许多人源性生化药品已更多地采取生物工程技术生产。当前已生产应用制品主要有血液制品类、人胎盘制品类和人尿制品类。

动物起源生化药品是天然生化药品主要品种,它含有原料起源丰富、价格低廉,便于综合利用和批量生产优点。第1页但因为提供原料动物种族差异较大,所以对原料品质和制品质控要比普通药品更为严格。

植物起源生化药品品种正逐年增加,如酶、蛋白质多糖和核酸等。

海洋生物起源生化药品是发展最快一大类生化药品。海洋生物种类繁多,是丰富药品资源宝库,含有很大发展潜力。第2页一、生物材料与生化活性物质(一)生化制药生物材料起源供生产生化药品生物资源主要有动物、植物、海洋生物和微生物组织、器官、细胞与代谢产物。应用动、植物细胞培养与微生物发酵技术也是取得生化制药原料主要路径。

基因工程技术与细胞工程技术和酶工程技术更是开发生化制药资源新路径。第3页1、动物脏器以动物组织器官为原料能够综合利用制备100各种生化药品。动物组织器官主要起源是猪,其次是牛、羊、家禽和鱼类等脏器。

l)胰脏

胰脏是动物体内不可替换实质性腺体之一。它兼有其它器官所没有内分泌和外分泌两种功效。

2)脑

脑组织富含脂质。脑组织中脂类占13.5%,蛋白质占8%~10%,还有少许黏多糖

脑组织中主要脂类物质是脑磷脂、肌醇磷脂、神经磷脂、脑苷脂、神经节苷脂和胆固醇。还有神经递质和各种神经肽。第4页

(3)胃黏膜胃是动物消化器官,主要分泌消化液、胃黏膜。(4)肝脏肝脏是机体内最大不可替换实质性腺体,是机体“生化反应器”。肝脏含有复杂酶系,已知肝脏酶达数百种,有些是其它组织所没有或者含量极少。如鸟氨酸氨基甲酰转移酶仅存在于肝细胞微粒体中。肝脏还含有不饱和脂肪酸、磷脂类和胆固醇。肝脏富有肝糖原及维生素A、D、E、Κ、B12等。第5页(5)脾脏脾脏是体内最大免疫器官,已用于生产药品有脾水解物,脾RNA和脾转移因子。人脾混合淋巴因子制剂对原发性肝癌含有良好疗效。(6)小肠小肠是消化和吸收主要场所,含有丰富淋巴组织和各种内分泌细胞。(7)脑垂体脑垂体是主要内分泌腺体,由两部分组成:脑垂体(前叶)包含远侧部、结节及中间部;神经垂体(后叶)包含神经部及漏斗部。垂体激素品种不少于10种。(8)心脏

心脏含有丰富糖原、激素和酶类。第6页

其它动物脏器如肺、肾、胸腺、肾上腺、扁桃体、甲状腺、睾丸、胎盘、羊精囊、气管软骨、眼球、鸡冠等也都是主要生物制药原料。2、血液、分泌物和其它代谢物血液约占体重6%~10%,血液中水分占80%,干物质占20%。血液资源丰富,可用于生产药品、生化试剂、营养食品、医用化装品及饲料添加剂等。尿液、胆汁、蛇毒、蜂毒等也是主要生物材料。第7页3、海洋生物海洋生物是开发防治常见病、多发病和疑难病药品主要生物材料。主要有:(1)海藻

海藻是海洋水生植物类,分绿藻门、褐藻门、蓝藻门、红藻门、甲藻门等10门,共10000各种。(2)腔肠动物腔肠动物是原始多细胞动物,有9000各种。(3)节肢动物节肢动物门中一些甲壳动物可供药用。甲壳动物有25000各种。第8页(4)软体动物软体动物有80000种,包含螺、蚌类和乌贼等。(5)棘皮动物棘皮动物有6000各种,包含海星、海胆、海参。(6)鱼类鱼类有0各种,可制造各种药品。(7)爬行动物爬行动物多数为陆生脊椎动物。海生主要有海蛇、海龟等。(8)海洋哺乳动物用鲸鱼和海豚类脏器和腺体已制成各种药品。其它海洋生物还有步骤、海绵、扁形、纽形、两栖等也都是主要生物材料。第9页4、植物药用植物品种繁多,除含有生物碱、强心苷、黄酮、皂苷、挥发油、树脂、鞣质等有效药理成份外,还含有氨基酸,蛋白质、酶、激素、糖类、脂类、维生素类等众多生化成份。由植物材料寻找有效生物药品已逐步引发重视,品种逐年增加,以及各种蛋白酶抑制剂。第10页5、微生物微生物资源非常丰富,已研究品种仅占自然界中微生物总数10%左右。微生物代谢物有1300各种,已大量生产才近百种。微生物酶有几千种,已被应用才几十种,可见其应用前景很大。(1)细菌惯用细菌发酵法生产。主要发展领域有:①氨基酸。②有机酸。③糖类。第11页④核苷酸类。⑤维生素。用细菌可制取各种维生素如VB1、YB2、VB6、烟酸、生物素等。⑥酶。(2)放线菌放线菌是最主要抗生素产生菌,己有1000各种抗生素约2/3产自放线菌。其代谢产物也是主要生物制药资源。①氨基酸。②核苷酸类。第12页③维生素。利用放线菌可产生维生素B12、B族维生素、胡萝卜素、蕃茄素及食品染料。④酶。放线菌能产生众多品种酶。(3)真菌①酶②有机酸。③氨基酸。④核酸及其相关物质。⑤维生素。⑥促生素。⑦多糖。第13页(4)酵母菌①维生素。②蛋白质与多肽。③核酸。6、开发生物新资源(1)动植物细胞大规模培养

利用动植物细胞大规模培养产生生物药品是细胞工程技术一大应用领域。(2)应用基因重组技术建立“工程菌”或“工程细胞”,使所需要基因在宿主细胞内表示,制造各种生物活性物质,是生物制药工业主要发展领域。第14页(二)生物材料准备1、生物材料选择生化药品生产原料选择标准是:有效成份含量高,原料新鲜、无污染;起源丰富、易得;原料产地较近,价格低廉;原料中杂质含量少,便于分离纯化等。(1)有效成份含量①生物品种

依据目标物分布,选择富含有效成份生物品种是选材关键。第15页②适当组织器官。

另外动物年纪、性别、营养情况、产地、季节对活性物质含量也有影响。植物原料要注意采集地点、季节,微生物原料要注意其对数生长久时间与活性成份关系。(2)杂质情况选材时,应防止与目标物性质相同杂质对纯化过程干扰。(3)起源应选取起源丰富材料,尽可能不与其它产品争原料,最好能一物多用,综合利用。第16页2、生物材料采集、预处理与保留生物材料采集时必须确保环境卫生符合要求,并尽力保持原材料新鲜,预防腐败、变质与微生物污染。生物材料采摘选取后,必须快速及时速冻,低温保留,预防生物活性成份变性、失活,酶原提取要及时进行,预防酶原激活转变为酶。

植物原料采集后可就地去除不用部分,将有用部分保鲜处理。

搜集微生物原料时,要及时将菌体细胞与培养液分开,依据有效成份存在部位及时进行保鲜处理。第17页

生物材料保留方法主要有:

①冷冻法。本法适合用于全部生物材料。普通先速冻后置于-40℃处低温保留。

②有机溶剂脱水法,惯用有机溶剂是丙酮。

③防腐剂保鲜法。惯用乙醇、苯酚等。二、生化活性物质提取(-)生化活性物质惯用提取方法1、酸、碱、盐水溶液提取法

第18页2、表面活性剂提取法与反胶束提取法

表面活性剂分子兼有亲水与疏水基团,分布于水-油界面时有分散、乳化和增溶作用。生物提取惯用表面活性剂,其HLB多在10~20之间。在适当pH及低离子强度条件下,表面活性剂能与脂蛋白形成微泡,使膜渗透性改变或使之溶解。第19页

反胶束也称为反胶团。反胶束是表面活性剂分散于连续有机相中自发形成纳米尺度一个聚集体。反胶束系统作为液-液萃取方法,更具选择性。此法优点是使热敏感性,亲水蛋白质在一个近似水相环境中被提取出来,最大程度地保持了蛋白质生物活性,蛋白质经过中间反胶束从一个主体相中转移到另一个水相中,并在瞬间完成。第20页3、有机溶剂提取用有机溶剂提取生化物质可分为固-液提取和液-液提取(萃取)二类。(1)固-液提取在生物制药中惯用有机溶剂有甲醇、乙醇、丙酮、丁醇等极性溶剂以及乙醚、三氯甲烷、苯等非极性溶剂。

极性溶剂现有亲水基团又有疏水基团,从广义上说,也是一个表面活性剂。甲醇、乙醇、丙酮能同水混溶,同时又有较强亲脂性,对一些蛋白质、类脂起增溶作用,

乙醚、三氯甲烷、苯是脂质化合物良好溶剂。第21页在选取有机溶剂时普通采取“相同相溶”标准。丁醇在水溶液中解离脂蛋白能力更强。在生化物质提取前,有时还用丙酮处理原材料,制成“丙酮粉”,其作用是使材料脱水,脱脂,使细胞结构涣散,增加了一些物质稳定性,便于贮存和运输。有机溶剂既能抑制微生物生长和一些酶作用,也能阻止大量无关蛋白质溶出,有利于深入纯化。第22页(2)液-液萃取

液-液萃取是利用溶质在两个互不混溶溶剂中溶解度差异将溶质从一个溶剂相向另一个溶剂相转移操作。影响液-液萃取原因主要有目标物在两相分配比(分配系数Κ)和有机溶剂用量等。第23页溶剂萃取注意事项:(1)pH

在萃取操作中正确选择pH很主要。所以,酸性物质在酸性条件下萃取,碱性物质在碱性条件下萃取,对氨基酸等两性电解质,则采取pH在等电点时进行提取很好。(2)盐析加入中性盐如硫酸铵、氯化钠等能够使一些生化物质溶解度降低,这种现象称作盐析。在提取液中加入中性盐,能够促使生化物质转入有机相从而提升萃取率:盐析作用也能降低有机溶剂在水中溶解度,使提取液中水分含量降低。第24页(3)温度

普通在室温或低温下进行萃取操作。(4)乳化液-液萃取时,常发生乳化作用。去乳化惯用方法有:过滤与离心;轻轻搅动;改变两相百分比;加热;加电解质;加吸附剂(如碳酸钙)等。

液-液萃取时溶剂选择要注意以下几点:(1)选取溶剂必须含有较高选择性。(2)选取溶剂,溶质与溶剂要轻易分离与回收。第25页(3)两种溶剂密度相差不大时,易形成乳化,选溶剂时应注意。(4)要选取无毒,不易燃烧价廉易得溶剂。4、双水相萃取法双水相系统是两种亲水性聚合物都加在一个水溶液中,当超出某一浓度时,就会产生两相,两种聚合物分别溶于互不相溶两相中。其操作是向水相中加入溶于水高分子化合物,如聚乙二醇(PEG)或葡聚糖,能够形成密度不一样两相(有时甚至是多相),因两相都含有较多水,所以称为双水相,惯用双水相系统为PEG/葡聚糖和PEG/无机盐两种,后者应用更广泛。第26页普通认为,成相是因为聚合物之间不溶性,即聚合物分子空间妨碍作用,无法相互渗透,不能形成均一相,从而含有相分离倾向。如用等量1.1%右旋糖酐溶液和0.36%甲基纤维素溶液混合,静止后,产生两相,上相中含右旋糖酐0.39%,含甲基纤维素0.65%,而下相中含右旋糖酐1.58%,含甲基纤维素0.15%。

第27页5、超临界萃取技术

超临界流体萃取技术优点是节能,对生化活性物质不产生热变性作用,可使用生理惰性溶剂在低温下分离活性组分。当在某一温度和压力时,气体和液体物理特征就会趋于相同。两相变为一相,此时称为临界点,物质临界点常数包含:临界温度、临界压力和临界密度。如CO2临界点分别为31.1℃、7.3MPa和0.47g/ml,当温度和压力高于临界点值时,物质处于液体和气体中间状态,在超临界状态下流体称为超临界流体,超临界流体最惯用萃取剂是CO2。第28页

超临界流体物理特征、传质特征通常介于液体和气体之间,适于作为萃取溶剂。

超临界流体含有与液体一样凝聚力、溶解力。密度与液体比较靠近。伴随温度和压力连续改变,超临界流体扩散系数靠近于气体,是通常液体近百倍,超临界流体黏度大大低于液体黏度,靠近气体黏度,有利于物质扩散。超临界流体溶解力与其密度有很大关系,而密度又受到体系温度或压力影响,所以压力或温度改变都会直接改变其溶解能力。第29页(二)提取效率提取时,总希望提取率愈高愈好,但实际上这种“相转移”提取效率不可能到达100%。在生物材料中总要残留部分目标物,残留量多寡取决于所选择溶剂系统种类、用量、提取次数以及操作条件。在实际工作中,溶剂用量有一定限量,所以普通用分次提取法给予填补。普通生产上多用2~3次提取。溶剂用量(L)为生物材料2~5倍,少数情况也有用10~20倍量溶剂作一次性提取。目标是节约提取时间,降低有害酶作用。第30页当提取物由固相转入液相或从细胞内转到细胞外时,提取率还与物质扩散作用相关。为了提升提取速度,常采取一些办法,如增加材料破碎程度,进行搅拌,延长提取时间,提升提取温度。(三)影响提取效率原因1、温度多数物质溶解度随提取温度升高而增加。另外较高温度能够降低物料黏度,有利于分子扩散和机械搅拌。应用有机溶剂提取生化成份时,普通在较低温度下进行提取,首先是为了降低溶剂挥发损失和生产安全,另首先也是为了降低活力损失。第31页2、酸碱度多数生化物质在中性条件下较稳定,所以提取用溶剂系统标准上应防止过酸或过碱,pH普通应控制在4~9范围内。为了增加目标物溶解度,往往要防止在目标物等电点附近进行提取。巧妙地选择溶剂系统pH,不但直接影响目标物与杂质溶解度,还能够抑制有害酶类水解破坏作用,预防降解,提升收得率。第32页3、盐浓度盐离子存在能减弱生物分子间离子键及氢键作用力。稀盐溶液对蛋白质等生物大分子有助溶作用。一些不溶于纯水球蛋白在稀盐中能增加溶解度,这是因为盐离子作用于生物大分子表面,增加了表面电荷,使之极性增加,水合作用增强,促使形成稳定双电层,此现象称“盐溶”作用。各种盐溶液盐溶能力既与其浓度相关,也与其离子强度相关,普通高价酸盐盐溶作用比单价酸盐盐溶作用强。第33页惯用稀盐提取液有:氯化钠溶液(0.1~0.15mol/L);磷酸盐缓冲液(0.02~0.05mol/L);焦磷酸钠缓冲液(0.02~0.05mol/L):醋酸盐缓冲液(0.10~0.15mol/L):柠檬酸缓冲液(0.02~0.05mol/L)。其中焦磷酸盐缓冲范围较大,对氢键和离子键有较强解离作用,还能结合二价离子,对一些生化物质有保护作用。

柠檬酸缓冲液常在酸性条件下使用,作用近似焦磷酸盐。第34页(四)提取方法选择生物材料及其目标物与提取相关一些性状包含溶解性质、分子量、等电点、存在方式、稳定性、相对密度、粒度、黏度、目标物含量、主要杂质种类及溶量解性质、相关酶类特征等。操作者可依据文件资料及本人试验探索取得相关信息,在提取过程中尽可能增加目标物溶出度,尽可能降低杂质溶出度,同时充分重视生物材料及目标物在提取过程中活性改变。第35页对酶类药品提取要预防辅酶丢失和其它失活原因干扰;对蛋白质类药品要预防其高级结构破坏(即变性作用),应防止高热、强烈搅拌、大量泡沫、强酸强碱及重金属离子作用。

多肽类及核酸类药品需注意防止酶降解作用,提取过程中,应在低温下操作,并添加一些酶抑制剂;对脂类药品应尤其注意预防氧化作用,降低与空气接触,如添加抗氧剂,通氮气及避光等。第36页在提取过程中,如蛋白质、酶及核酸类药品常采取以下保护办法。(1)采取缓冲系统

预防提取过程中一些酸碱基团解离造成溶液pH大幅度改变,使一些活性物质变性失活或因pH改变影响提取效果。在生化药品制备中,惯用缓冲系统有磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、Tris缓冲液、醋酸缓冲液、碳酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等,所使用缓冲液浓度均较低,以利于增加溶质溶解性能。第37页(2)添加保护剂预防一些生理活性物质活性基团及酶活性中心受破坏,如巯基是许多活性蛋白质和酶催化活性基团,极易被氧化,故提取时,常添加一些还原剂如半胱氨酸、β-巯基乙醇、二巯基赤鲜糖醇、还原型谷胱甘肽等。其它办法如提取一些酶时,常加入适量底物以保护活性中心。对易受重金属离子抑制活性物质,可在提取时添加一些金属螯合剂,以保护活性物质稳定性。第38页(3)抑制水解酶作用

抑制水解酶对目标物作用是提取操作中最主要保护性方法之一。如需要金属离子激活水解酶(如DNase)常加入EDTA或用柠檬酸缓冲液,使水解酶活力受到抑制。对热不稳定水解酶,可用热变性提取法,使酶失活。依据酶溶解性质不一样,可用pH不一样缓冲体系提取,以降低酶释放或依据酶最适pH,选取酶发挥活力最低pH进行提取。最有效方法是在提取时,添加酶抑制剂。第39页(4)其它保护办法

为了保持一些生物大分子活性,还要注意防止紫外线、强烈搅拌、过酸、过碱或高温、高频震荡等。有些活性物质还应预防氧化,如固氮酶、铜-铁蛋白提取分离时要求在无氧条件下进行,有些活性蛋白对冷、热改变也十分敏感,如免疫球蛋白就不宜在低温冻结。所以提取时要依据目标物不一样性质,详细对待。第40页三、生化活性物质浓缩与干燥(一)生化活性物质浓缩生化活性物质提取液在深入分离、提纯前,依据物料性能可采取不一样方法浓缩,因为多数生化活性成份对热不稳定,所以常采取一些较为缓解浓缩方法。1、盐析浓缩用添加中性盐方法来使一些蛋白质(或酶)从稀溶液中沉淀出来,从而到达样品浓缩目标。最惯用中性盐是硫酸铵,其次是硫酸钠、氯化钠、硫酸镁、硫酸钾等。第41页2、有机溶剂沉淀浓缩在生物大分子水溶液中,逐步加入乙醇、丙酮等有机溶剂,能够使生化物质溶解度显著降低,从溶液中沉淀出来,这也是浓缩生物样品惯用方法。其优点是溶剂易于回收,样品无须透析除盐,在低温操作下,对各种生物大分子较为稳定,但对一些蛋白质或酶却易使它们变性失活,应小心操作。应用本法取得浓缩物,为预防生物活性物质变性应尽快除去有机溶剂。第42页3、用葡聚糖凝胶(Sephadex)浓缩加入固体干葡聚糖凝胶G-25,迟缓搅拌30min,葡聚糖凝胶吸水膨胀,进行吸滤,生物大分子全部留在溶液中,如此重复数次,可在短时间内使溶液浓缩到l00ml,每次葡萄糖凝胶加入量为溶液量1/5为宜,用过葡聚糖凝胶经蒸馏水洗净后,可用乙醇脱水,干燥后重复使用。第43页4、用聚乙二醇浓缩将待浓缩液放入透析袋内,袋外覆以聚乙二醇,袋内水分很快被袋外聚乙二醇所吸收,在极短时间内,能够浓缩几十倍至上百倍。5、超滤浓缩应用不一样型号超滤膜浓缩不一样分子量生物大分子。

第44页6、真空减压浓缩与薄膜浓缩

真空减压浓缩在生物药品生产中使用较为普遍,浓缩目标是除去挥发性溶剂,保持物料生物活性,如薄膜蒸发器便是其中一例。

薄膜蒸发进行方式有二:一是使液膜快速流过加热面而蒸发,另一是使物料猛烈地沸腾,产生大量泡沫,以泡沫内外表面为蒸发面进行蒸发,后一方法使用较普遍。第45页第46页(二)干燥干燥是使物质从固体或半固体状经除去存在水分或他种溶剂,从而取得干燥物品过程。水分在干燥物料中,有三种情况:即表面水、毛细管中水与细胞内水。表面水很轻易经过汽化除去。毛细管中水,因为毛细管壁作用,较难除去。

细胞内水因为被细胞膜包围封闭,如不扩散到膜外则不轻易蒸发除去。第47页干燥速度在温度及压力不变条件下取决于液体抵达表面速度。物质在空气中干燥度,也常称为物质平衡湿度,在一定条件下是一个不变值。所以,除非改变大气温度,湿度或压力。干燥多用加热法进行。惯用方法有膜式干燥、气流干燥、减压干燥等。另外,冷冻干燥、喷雾干燥以及红外线干燥等也常选取。第48页1、减压干燥

减压干燥是在密闭容器中抽去空气后进行干燥方法,亦称真空干燥。2、喷雾干燥

喷雾干燥是流化技术用于干燥最早方法。待干燥物质先浓缩成一定浓度液体。因为液体经喷雾后含有极大表面,故能在很短时间内干燥,使受热时间缩短,而且干燥物为粉状,不需粉碎即可应用。第49页第50页3、冷冻干燥

冷冻干燥是在低温、低压条件下,利用水升华性能而进行一个干燥方法。在预冻结过程中,制品预冻有两种方式:其一是制品与干燥箱同时降温;另一个是待干燥箱搁板降温至-40℃左右,再将制品放入。前者相当于慢冻,后者则介于慢冻与速冻之间。

第51页

冷冻干燥机系由制冷系统、真空系统、加热系统、电器仪表控制系统所组成,主要部件为干燥箱、凝结器、冷冻机组、真空泵组和加热装置等(图2-3)。第52页第53页四、生化活性物质分离与纯化1、生化制药工艺中分离制备方法特点

生化分离技术包含:生化分离分析和生化制备。前者主要对生物体内各组分加以分离后进行定性、定量判定。而后者则主要是为了取得生物体内某一单纯组分。生物制药工艺中分离制备方法有以下特点:(1)生物材料组成非常复杂。其中有不少化合物迄今还是未知物,而且生物活性物质在分离进程中仍处于不停代谢改变中,所以常无固定操作方法可循。第54页(2)有些化合物在生物材料中含量极微,所以分离操作步骤多,不易取得高收率。(3)生物活性成份离开生物体后,易变性破坏,必须十分小心地保护这些化合物生理活性,这也是生物制药中分离、制备难点。(4)生物制药中分离方法几乎都在溶液中进行,各种参数(温度、pH、离子强度等)对溶液中各种组分综合影响经常无法固定,以致许多试验设计理论性不强。试验结果经常带有很大经验成份。第55页(5)为了保护目标物生理活性及结构上完整性,生物制药中分离方法多采取温和“多阶式”方法进行,即常说“逐层分离”方法。(6)生物产品最终均一性证实与化学上纯度概念不完全相同,因生物分子对环境反应十分敏感,结构与功效关系比较复杂,故对其均一性评定经常是有条件,只凭一个方法得到纯度结论往往是片面,甚至是错误。第56页2、生化制药工艺中分离制备方法基本原理生物大分子分离纯化主要原理是:(1)依据分子形状和大小不一样进行分离。如差速离心与超离心、膜分离(透析、电渗析)超滤法凝胶过滤法。(2)依据分子电离性质(带电性)差异进行分离。如离子交换法、电泳法、等电点聚焦法。(3)依据分子极性大小及溶解度不一样进行分离。如溶剂提取法、逆流分配法、分配层析法、盐析法、等电点沉淀法及有机溶剂分级沉淀法。(4)依据物质吸附性质不一样进行分离。如选择性吸附与吸附层析法。第57页(5)依据配体特异性进行分离——亲和层析法。3、分离纯化基本程序和试验设计生物体内某一组分,尤其是未知结构组分分离制备设计大致可分为五个基本阶段:(1)确定制备物研究目标及建立对应分析判定方法;(2)制备物理化性质和稳定性预备试验;(3)材料处理及抽提方法选择;第58页(4)分离纯化方法探索;(5)产物均一性测定。提取是分离纯化目标物第一步,所选取溶剂应对目标物含有最大溶解度,并尽可能降低杂质进入提取液中,为此可调整溶剂pH、离子强度、溶剂成份配比和温度范围等。分离纯化是生化制备关键操作。所以合理分离纯化方法是依据目标物理化性质与生物学性质依详细试验条件而定。依据分析和预试验初步结果,参考他人对类似物质分离纯化经验,也能够少走弯路。第59页4、分离纯化方法步骤优劣综合评价每一个分离纯化步骤好坏,除了从分辨能力和重现性二方面考虑外,还要注意方法本身回收率。5、制备物均一性判定一个制备物是否纯,常以“均一性”表示。均一性是指所取得制备物只含有一个完全相同成份。均一性评价常须经过数种方法验证才能必定。第60页假如某物质所含有物理、化学各方面性质经过几个高灵敏度方法判定都是均一,那么大致能够认为它是均一。当然,伴随更加好判定方法出现,还可能发觉它不是均一。绝正确标准只有把制备物全部结构搞清楚,并经过人工合成证实含有相同生理活性时,才能必定制备物是绝对纯净。生物分子纯度判定方法很多,惯用有溶解度法、化学组成份析法、电泳法、免疫学方法、离心沉降分析法、各种色谱法、生物功效测定法,以及质谱法等。第61页第二节微生物制药工艺技术基础-、微生物菌种选育与菌种保藏(一)菌种分离与筛选1、菌种分离(1)含菌样品搜集依据微生物生态特点,从自然界取样,分离所需菌种,普通可从土壤中分离。

第62页(2)富集培养搜集到样品若含所需要菌较多,可直接分离。若含所需要菌极少,就需要经过富集培养,使所需要菌大量生长,以利筛选。再配合控制温度、pH或营养成份即可到达目标。(3)菌种纯化在自然条件下,各种类型菌混杂在一起生长,所以要进行分离,以取得纯种。菌种纯化方法普通采取稀释分离法或划线分离法。2、菌种筛选筛选前,先要考虑哪些微生物是筛选对象。第63页(二)菌种选育与保藏1、菌株选育发酵生产,从自然界直接分离到菌种,都不能适合实际生产需要。只有经过诱变、选育才能使产量成倍、成百倍地提升。(1)自然选育

自然选育是一个纯种选育方法。它利用微生物在一定条件下产生自发突变原理,经过分离、筛选排除衰变型菌落,从中选择维持原有生产水平菌株。所以,它能到达纯化、复壮菌种,稳定生产目标。

自然选育普通包含单孢子悬浮液制备、分离及单菌落培养、筛选等操作过程。第64页(2)诱变育种

诱变育种是指有意识地将生物体暴露于物理、化学或生物一个或各种诱变因子,促使生物体发生突变,进而从突变体中筛选含有优良性状突变株过程。①出发菌株选择出发菌株是用于诱变原始菌株,选择出发菌株时,应考虑以下问题:a、出发菌株稳定性,尽可能挑选纯系菌株,以排除异核体系与异质体菌株,所以对选定出发菌株常需经过自然选育深入纯化;第65页b、选取具备某种优良特征菌株。c、拟选对诱变剂敏感菌株,以提升突变频率;d、菌种生理状态及生长发育时间,因为诱变剂对处于转录状态或翻译状态菌种效应要比静止状态或休眠状态菌种敏感得多。普通细菌处于营养体,比处于对数生长久菌体为佳。真菌和放线菌则以它们孢子,或处于刚开始萌发状态孢子为佳。为了确保菌体和诱变剂均匀接触,出发菌株都必须制备成单细胞(孢子)悬浮液,严格控制单孢子分散度在95%以上。第66页②诱变处理能够提升生物体突变频率物质称为诱变剂。当前使用诱变剂可分为物理诱变因子、化学诱变剂和生物诱变因子三大类。屡次重复用同一个诱变因子处理易出现“饱和”或回复突变现象,所以常采取各种不一样诱变因子或复合因子诱变。

a、物理诱变:物理诱变因子主要包含紫外线(UV)、Ⅹ射线、γ射线、快中子(FN)、β射线、超声波、激光等,其中以紫外线辐照使用最为普遍。近年来用离子束注入细胞技术进行诱变育种。第67页b、化学诱变:化学诱变剂是一些能和DNA起作用,改变其结构,并引发遗传变异化学物质。化学诱变剂据其与DNA作用方式不一样有3类:①烷化剂如氮介、乙烯亚胺、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯、亚硝基脲、亚硝酸等,它们与DNA碱基起反应,引发碱基配正确转换而发生遗传变异;第68页②碱基类似物,它们掺入到DNA分子中而造成遗传变异如5-溴尿嘧啶(5-BU)、5-氟尿嘧啶(5-FU)等;③移码诱变剂如吖啶黄、吖啶橙等。它们可插入DNA双螺旋邻近碱基对之间造成碱基插入或缺失造成转录和翻译移码突变。第69页

c、生物诱变:噬菌体可作为诱变剂应用于抗噬菌体菌种选育,其作用原理可能与传递遗传信息,诱发抗性突变相关。

诱变剂量选择能够提升正变株取得率诱变剂量即为最适剂量,普通情况下,诱变处理后细胞死亡率越高,活下来细胞突变率也越高,故可用死亡率作为相对剂量。在自动化程度高大规模筛选中,常采取死亡率在90%~99.9%高剂量,小规模人工筛选,普通采取死亡率70%~90%低剂量,也有报道采取死亡率40%~60%更低剂量。第70页

增变剂使用,氯化锂本身并无诱变作用,但在抗生素产生菌诱变育种中表明氯化锂与一些诱变因子含有协同作用。

氯化锂使用剂量普通为0.5%,处理方法多是后处理,即加在平板培养基中,在菌种生长发育过程中发生作用。第71页③突变株筛选

a、随机筛选:随机筛选指菌种经诱变处理后,凭经验随机选择一定数量菌落,其中包含未发生突变野生型菌株和发生突变后正向及负向突变株,再进行摇瓶筛选。

b、半理性化筛选:近年来,伴随遗传学、生物化学知识积累,人们对各种抗生素生物合成路径及代谢调控机制了解不停深入,抗生素产生菌推理选育技术应运而生、即依据已知或可能生物合成路径、代谢调控机制和产物分子结构来设计筛选方法,以打破微生物原有代谢调控机制,取得能大量形成产物高产突变株。第72页(3)当代菌种选育技术①杂交育种

杂交育种普通指将两个基因型不一样菌株经过接合使遗传物质重新组合,再从中分离和筛选出含有新性状菌株。

杂交育种是选取已知性状供体菌株和受体菌株作为亲本,把不一样菌株优良性状集中于重组体中。所以杂交育种含有定向育种性质。杂交育种使得遗传物质重新组合,扩大了变异范围,改进了产品质量和产量。第73页②原生质体融合用脱壁酶处理将微生物细胞壁除去,制成原生质体,再用聚乙二醇(PEG)促进原主质体发生融合,从而取得融合子,这一技术叫原生质体融合。原生质体融合重组频率高于普通杂交方法,并实现了种间、属间融合,为亲缘关系较远、性能差异较大菌株实现杂交,开辟了一条有效路径。第74页③基因工程技术基因工程技术可完成超远缘杂交,是将某一生物体(供体)遗传信息在体外经人工与载体相接(重组),组成重组DNA分子,然后转入另一微生物体(受体)细胞中,使外源DNA片段在后者内部得以表示和遗传。所以基因工程是在分子生物学理论指导下一个自觉、能像工程一样可事先设计和控制育种技术。第75页2.菌种保藏(1)菌种退化与预防

退化意味着随时间推移菌种一个或多个特征逐步减退或消失。普通把菌株生活力、产孢子能力衰退和特殊产物产量下降统称为退化。菌株遗传性状是稳定,不过也可能发生突变。所以,能够在基因型改变情况下引发菌种退化。在传代过程中回复突变数量逐步取得优势过程,也就是菌种退化过程。所以基因突变能够使原来纯菌株变为不纯,不纯菌株在传代过程中不停增加百分比,从而造成群体退化。第76页菌种退化现象综合比较判别是:

①单位容积中发酵液活性物质含量;②琼脂平皿上单菌落形态;③不一样培养时期菌体细胞形态和主要遗传特征,如形成孢子能力;④发酵过程pH变动情况;⑤发酵液气味、色泽。第77页菌种退化问题十分复杂,对其规律尚缺乏了解。所以,只能提供一些标准性预防办法。①预防基因突变,基因突变是菌种退化一个主要原因,应用低温保藏法能够降低突变发生;②采取双重缺点型,利用营养缺点型作为生产菌株时,回复突变可造成产量下降,采取双重缺点标志可间接而有效地预防突变;③制订科学管理制度,使用菌种时大批制作平行菌种斜面,少转接传代;④分离单菌落,在建立新菌株和使用过程中认真进行单菌落分离,再多制作平行菌种斜面;第78页⑤选择培养条件,选择有利高产菌株而不利于低产菌株培养条件。(2)惯用菌种保藏法微生物菌种在屡次传代中,会发生遗传性变异,而且退化性变异是大量,所以微生物菌种应妥善保藏,使之能长久保持存活、不退化,便于生产和科研使用。

菌种保藏原理是依据菌种生理、生化特点,创造条件使菌体代谢处于不活泼状态。第79页保藏时,先挑选优良纯种,最好是选取它们休眠体(孢子、芽孢等),然后创造一个最有利于休眠环境条件(如低温、干燥、缺氧和缺乏营养物质等),以降低菌种代谢活动速度,到达延长保留期目标。一个很好保藏方法,首先要求能较长久地保留原有菌种优良特征,但也要考虑方法本身经济简便。第80页①斜面低温保藏法。斜面低温保藏法是最早使用而且现今依然普遍采取方法。详细方法是将菌种接种于所要求斜面培养基上,置最适温度下培养,待得到健壮菌体后,放在4℃左右,湿度小于70%条件下保藏,每间隔一定时间重新移植培养1次。

普通,细菌每个月移植一次,放线菌每3个月移植一次,酵母菌每4~6个月移植一次,丝状真菌每4个月移植一次。保留期间应注意冰箱温度,不能波动太大,切忌保留在0℃以下,不然培养基会结冰脱水,造成菌种性能衰退。第81页

②液体石蜡封藏法。在长好菌苔斜面试管中,加入灭过菌液体石蜡,可预防或降低培养基内水分蒸发,隔绝培

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