DB64T-奶牛活体采卵体外胚胎生产与移植技术规程

ICS FORMTEXT65.020.30FORMTEXTCCSB43FORMTEXT     DBFORMTEXT  DBFORMTEXT64/FORMTEXTXXXXX—FORMTEXT2024FORMTEXT     FORMTEXT奶牛活体采卵体外胚胎生产与移植技术规程FORMTEXT     FORMTEXTSpecificationTechnicalregulationsforinvitroembryoproductionandtransferoflivecoweggs     FORMDROPDOWNFORMTEXT     FORMTEXT2024-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布FORMTEXT2024-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施FORMTEXT宁夏回族自治区市场监督管理厅   发布DB64/XXXXX—XXXX前  言本文件的编写格式符合GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的要求。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由宁夏回族自治区农业农村厅提出、归口并实施。本文件起草单位：宁夏回族自治区畜牧工作站，宁夏反刍种性研究科技有限公司。本文件主要起草人：脱征军，周佳敏，吉广强等。本文件为首次发布。奶牛活体采卵体外胚胎生产与移植技术规程范围本文件规定了荷斯坦奶牛活体采卵体外胚胎生产与移植技术的术语与定义，确立了体外胚胎生产与移植操作方法及流程，明确了供体的选择与处理、卵母细胞的采集、体外胚胎生产、胚胎质量鉴定、胚胎冷冻保存、胚胎移植与妊娠检查等方面的技术要求。本文件适用于宁夏回族自治区荷斯坦奶牛体外胚胎生产与移植的规范化操作。规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T3157中国荷斯坦牛GB/T16292医药工业洁净室(区)悬浮粒子的测试方法GB/T25881牛胚胎GB/T26938牛体内胚胎生产与移植技术规程GB50346生物安全实验室建筑技术规范NY/T2695牛遗传缺陷基因检测技术规程TNAASS015宁夏奶牛发情鉴定技术规程TNAASS016宁夏高产奶牛胚胎移植技术规程术语和定义GB/T25881和TNAASS016界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1奶牛胚胎embryoofdairycow主要指荷斯坦母牛胚胎。3.2活体采卵ovumpick-up,opu是指通过非手术的方式，在对供体牛影响最小的情况下从活体卵巢中采集（吸取）卵母细胞的方法。一般通过B超仪、采卵仪等设备，在真空状态下用采卵针将卵母细胞吸至体外的过程。3.3体外受精invitrofertilization精子和成熟卵母细胞在体外培养条件下完成受精的过程。3.4体外培养invitroculture受精卵在体外适宜环境下培养成囊胚的过程。3.5体外胚胎生产与移植InvitroembryoproductionandTransplantation从活体卵巢上获得卵母细胞，通过体外成熟、受精、培养获得发育优质的胚胎后，选择与供体生理状况相近的受休牛，用非手术方法将胚胎移植到受体牛黄体侧子宫大弯处，便于胚胎继续发育。所用试剂和器械应符合附录A的规定。3.6体外受精实验室IVFLaboratory符合万级净化车间标准的实验室可作为体外受精实验室，按照GB/T16292的规定执行。4供体的选择与处理4.1供体的选择4.1.1年龄和体况。8月龄以上，体高≥130cm，体重≥380kg的青年母牛或场内遗传评估前20～25%的经产牛为宜。体况及膘情适中，体况评分2.75~3.25分为宜(5分制)。4.1.2遗传性能。符合GB/T3157的品种标准，具有较高的生产性能，三代系谱完整，种用价值高，遗传性能稳定。4.1.3繁殖性能。生殖系统健康，发情记录规范，繁殖性能良好，激素处理后卵泡（≥2mm）数超过10个。4.1.4健康状况。无NY/T2695规定的牛遗传缺陷病，无《中华人民共和国动物防疫法》第573号公告规定的一、二、三类动物疫病病种。4.2供体的处理4.2.1同期发情采用肌肉注射前列腺素法，在发情周期的任意一天注射PGF2α,发情后第4-6d开始采卵。4.2.2超数排卵自然发情或PGF2α法发情的供体，肌肉注射FSH，每天早、晚各1次，间隔12h,连续4d，剂量递减。方法参见附录B。4.2.3重复超数排卵供体可重复超数排卵，2次超排间隔时间宜大于14d。方法按照4.2.2的规定执行。4.2.4供体发情鉴定按照TNAASS015的规定执行。5卵母细胞的采集5.1采卵前准备5.1.1材料准备准备充足的（采卵针、采卵管）、离心管、耦合剂等材料，根据供体牛头数提前配制采卵液，每50ml采卵液加入500单位肝素钠，每个50ml离心管中加入10ml配制好的采卵液，每头供体牛分装两管，采卵液加热至37-38℃。5.1.2仪器准备采卵车台面喷洒75%酒精彻底消毒20min，检查采卵仪各部件是否正常工作，将50mL离心管置于恒温槽上，与负压泵和穿刺针连接，吸取少量采卵液润洗采卵管。5.1.3供体牛准备保定供体，清除直肠宿粪，检查供体牛卵巢状态，并用黏液吸除棒将阴道内黏液清理干净。2%利多卡因硬膜外麻醉，剂量3mL/头为宜，根据供体膘情与体重适量增减。用0.01%高锰酸钾清洗会阴部及外阴，75%酒精消毒外阴后用生理盐水冲洗，纱布擦拭外阴。5.2采卵操作5.2.1操作人员一只手将采卵仪的超声波探头插入供体阴道至穹隆处，另一只手通过直肠把握将一侧的卵巢牵拉至采卵仪探头端部。5.2.2选择清晰可见的卵泡（直径≥2mm的卵泡均可穿刺），推进采卵针，采卵针穿过阴道壁，刺破卵泡壁的同时用脚踏开关控制负压泵抽吸卵泡液至离心管中，负压泵压力控制在50-100mmHg。5.2.3采用同样的方法采集另一侧卵巢卵母细胞。5.2.4采卵助手及时记录供体牛号、左右卵巢所穿刺卵泡的大小和数量、采卵时间、供体牛类别、采卵员等信息，并在离心管标记供体牛号和卵母细胞数，在30min内将含有卵母细胞的离心管装入保温箱送达实验室。5.2.5每头供体采卵时间应控制在10分钟以内。5.2.6采卵频率，根据实际需要每周采1次或每月采卵2次，头胎牛配种前可进行采卵。6体外胚胎生产6.1检卵检出含3层以上卵丘细胞的卵丘-卵母细胞复合体(COCs)，用洗卵液清洗2~3次，再用卵母细胞成熟液洗涤2~3次，然后移入装有成熟液的4孔板中培养。各种培养液可自行配制，也可购买具有资质公司的产品。6.2卵母细胞的分级在体视显微镜下将卵母细胞分为四级，应选择A级和B级的COCs进行体外培养。(见附录C中的图C)。6.3卵母细胞体外培养与成熟6.3.1培养条件体外胚胎在培养箱中进行，培养温度为38.5℃，培养气相为5%CO2气体，湿度为饱和湿度。6.3.2培养方法采用微滴法将卵母细胞置于二氧化碳培养箱中培养。用采卵液清洗3遍挑选出A级和B级可用的卵母细胞，在成熟培养液中清洗3遍，移入成熟液微滴中，每微滴成熟液体积为50~200μL。每个供体来源的卵母细胞应单独培养，每个微滴宜培养15~20个卵母细胞。如使用四孔板，则每孔750μL成熟液、50枚COCs。卵母细胞体外成熟的判定标准为卵丘细胞充分扩散，第一极体排出。6.3.3成熟培养时间卵母细胞成熟培养时间一般为22~24h6.4卵母细胞体外受精6.4.1供精种公牛验证公牛技术参数依据当年美国红皮书或中国乳用种公牛遗传评估概要，可靠性R≥90%，基因组公牛技术参数依据当年美国红皮书，可靠性R≥70%。6.4.2精液处理6.4.2.138℃水浴解冻冷冻精液。6.4.2.2将精液置入含有7mL洗精液的15mL离心管中，1800r/min离心8min。6.4.2.3弃上清液，再加入7mL洗精液1800r/min离心8min。6.4.2.4弃上清液后，将精子用受精液悬浮，调整精子密度为1x106个/mL。6.4.2.5取90μL精子悬浮液加入平衡2h以上的10μL受精滴中，形成100μL受精滴，加入适量矿物油覆盖。6.4.2.6将受精滴置于培养箱中平衡1.5h，使精子充分获能。6.4.3体外受精6.4.3.1用平衡好的受精液洗涤COCs，吸取胞质均匀的成熟卵母细胞，放入受精滴中(20枚/100μL)受精，受精滴加适量精液。6.4.3.2用0.25%透明质酸酶消化培养后的COCs，用口吸管反复吹打透明质酸酶，脱除颗粒细胞。6.4.3.3将受精卵移入胚胎培养液微滴中，置于38.5℃、5%CO2的培养箱中培养48h，每个微滴培养10~15枚胚胎为宜。6.5受精卵分级培养移除死亡和未受精的COCs，将正常受精卵移入新培养液以后隔天半量换液，在二氧化碳培养箱中继续培养7~8d，至发育到囊胚阶段。7胚胎质量鉴定7.1胚胎发育阶段及分级评定胚胎发育阶段划分及分级评定应符合GB/T25881中的规定。胚胎质量分为A、B、C、D四个等级，其中A、B级为可用胚胎。7.2可用胚胎的判定在体视显微镜下对胚胎进行形态学观察，凡形状呈圆球形或接近圆球形，卵裂球大小一致、胞质均匀、连接紧密，内细胞团外部轮廓清晰、规则，含液泡、胞质浓缩呈颗粒状的退化细胞数量少，卵周隙内没有或有少量外溢的退化细胞，明暗适中，发育阶段与胚龄相符的胚胎为可用胚胎。8胚胎冷冻保存按照GB/T26938规定执行。9胚胎移植与妊娠检查9.1胚胎移植按照TNAASS016-2022的第9章执行。9.2妊娠检查按照TNAASS016-2022的第9.5和9.6执行。附录A(规范性)主要设施设备、器械与试剂A.1设施胚胎实验室建设，按照GB50346相关内容执行。A.2同期发情、超数排卵所需主要试剂和器械FSH（促卵泡素follicle-stimulatinghormone)、COCs(卵丘-卵母细胞复合体cumulus-oocytecomplexes)、PGF2α（前列腺素ProstaglandinF2α）、LH(促黄体素luteinizinghormone)等。解冻杯、温度计、细管剪、剪毛剪、镊子、兽用B超仪和注射器等。A.3卵母细胞采集所需主要试剂和器械活体采卵仪、（负压泵、离心管）、保定架、75%酒精、0.1%高锰酸钾、2%利多卡因、耦合剂等。采卵针、采卵管、吸胚管、黏液吸除棒、注射器、集卵杯(侧漏式或底漏式)、胚胎运输箱、蜡笔和针头等。A.4检胚所需主要操作液采卵液、清洗液和成熟液。A.5胚胎培养所需主要试剂和设备成熟液、受精液、胚胎培养液等。体视显微镜、离心机、离心管、精子密度测定仪、CO2培养箱(38.5℃、5%CO2、饱和湿度)、三气培养箱(38.5℃、5%CO2、7%O2、饱和湿度)、高温干燥箱、恒温台、热板、水浴锅、气瓶（二氧化碳气体、高纯氮气）、冰箱、超净工作台、超声波清洗仪、UPS电源、液氮罐、0.25mL胚胎细管、细管塞、装管器、玻璃针(或胚胎吸头)、培养皿和记号笔等。A.6胚胎移植和妊娠检查所需主要试剂和器械按照TNAASS016规定执行。附录B(资料性)FSH注射时间、剂量B.1供体注射FSH，采用4d6次剂量递减方法，每次注射时间间隔12h。B.2供体注射FSH的时间和剂量示例，见表B。表BFSH注射时间、剂量处理天数第1天第2天第3天第4天第5天第6天早8:00FSH5mlFSH3mlFSH0.5ml采卵晚20:00FSH5.5mlFSH3.5mlFSH2.5ml注1：以加拿大生产FSH为例（规格：400 mg/瓶），每瓶FSH用20ml生理盐水稀释，使用5ml注射器肌肉注射到牛只臀部处（髋结节后方）。注2：适宜剂量可根据FSH制剂、供体品种、体型、膘情进行调整。附