高三生物二轮复习微专题：PCR技术中的引物课件

PCR技术中的引物生物二轮复习微专题PCR实验原理介绍近年部分高考试题中相关内容考察卷序

试题试题分析考察引物课标要求2023年浙江卷考察基因编辑技术，属于情境题√1、阐明基因工程的基本操作程序主要包括目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞和目的基因及表达产物的检测鉴定等步骤2、教学提示：利用聚合酶链式反应（PCR）扩增DNA片段并完成电泳鉴定，或运用软件进行虚拟PCR实验2023年山东卷考察PCR技术，属于情景题√2023年湖北卷考察PCR技术，属于理解题2022年湖北卷考察PCR技术，属于材料分析题2022年福建卷考察基因工程，属于理解题√2021年全国卷考察PCR技术，属于识记题√2021年湖北卷考察PCR技术，属于情境题√考察PCR技术，属于材料分析题2020年北京卷√考察PCR技术的应用，属于情境题2020年江苏卷。。。。。。。。。。。。PCR中的引物：别怕！我们一起来解决！！课标有要求，教材呈现有限，高考考察难度大，教材中的引物1、引物是：2、引物的作用：一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸使Taq酶能够从其3’端开始连接脱氧核苷酸一、引物的作用例题1（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题;PCR反应体系中含有热稳定DNA聚合酶，下面的表达式不能正确反映DNA聚合酶的功能，这是因为___

_______

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DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能将单个脱氧核苷酸连续结合至双链DNA片段的引物链上。二、引物的设计例题2(2021.湖北)某实验利用PCR技术获取目的基因,实验结果显示,除了目的基因条带(引物与模板完全配对)外,还有2条非特异条带(引物和模板不完全配对)。为了减少反应中非特异条带的产生，以下措施中有效的是A.增加模板DNA的量B.延长热变性的时间C.延长延伸的时间D.提高复性的温度答案：D1、一般而言，引物越长，G+C比例越高，退火温度越高，扩增特异性强。二、引物的设计例题3（2011年江苏卷）请回答基因工程方面的有关问题∶设计引物是PCR技术关键步骤之一。某同学设计的2组引物如图，都不合理，请分别说明理由。①第1组：_____________

_;②第2组：________

_____________。引物1和引物11局部发生碱基互补配对而失效

引物1自身折叠后会出现局部碱基互补配对而失效

×

×2、引物自身

不应存在互补配对

序列（发夹结构）；

两条引物之间

不应存在互补配对

序列。二、引物的设计例题4（2019·江苏）（节选）图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗性基因（tetr)和氨苄青霉素抗性基因（ampr）。请回答下列问题：（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确插入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为甲、乙、丙3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是

。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是

乙、丙选择了引物甲和乙并且目的基因反向连接三、引物的应用1、通过选择合适的引物，确定目的基因的正确插入方向

原理是：

用限制酶剪切该DNA，随后使用DNA连接酶将获得的酶切产物环化，这样就获得了已知序列两侧携带有未知序列的环状DNA分子。以该已知序列为模板设计一对相反方向的特异性引物，该引物对已知序列反向，但对未知序列却是相向的，从而得以扩增出未知序列。反向PCR

如何扩增已知序列两端的未知序列呢？②④

DNA序列(虚线处省略了部分核苷酸序列)已知序列PCR引物①5′—AACTATGCGCTCATGA—3′②5′—GCAATGCGTAGCCTCT—3′③5′—AGAGGCTACGCATTGC—3′④5′—TCATGAGCGCATAGTT—3′例题5(2022·江苏卷)（节选）如果已知一小段DNA的序列，可采用PCR的方法，简捷地分析出已知序列两侧的序列，具体流程如图所示(以EcoRⅠ酶切为例)。请据图回答问题：(3)若下表所列为已知的DNA序列和设计的一些PCR引物，步骤Ⅲ选用的PCR引物必须是________(从引物①②③④中选择，填编号)。三、引物的应用2、巧妙设计引物，通过反向PCR，实现对已知序列两侧的未知序列的扩增。例题6、常见的病毒疫苗有灭活疫苗、蛋白疫苗和重组疫苗等。已知某甲流病毒的特异性蛋白N（具有抗原性）的cDNA编码序列（目的基因）如下图。为了制备稳定性更好的N蛋白疫苗，可以通过对目的基因加以改造，使PCR扩增出的编码序列在图中标记处的GTG改为ATG,再通过基因工程技术获得大量稳定蛋白N。请设计引物1、引物2的碱基序列。3'ATCGCCTAGAACGCTT5'5'TGGATACGTAGTACAT3'引物中改变个别碱基，不影响引物与模板链的结合，实现定点诱变1.若要将基因内部的G/C碱基对替换成A/T碱基对，引物又该设计几种呢？如何设计？引物1引物2引物3引物45'TGGACACGTAGTACAT3'5'ACATCGACACACAATC3'5'TTCGCAAGATCCGCTA3'5'GATTGTGTGTCGATGT3'

引物15’

TGGACACGTAGTACAT......ACATCGACACGCAATC......TAGCGGATCTTGCGAA3’3’ACCTGTGCATCATGTA.......TGTAGCTGTGCGTTAG.......ATCGCCTAGAACGCTT5’引物22.进行PCR时是4种引物一起加入，还是两两分组加入？如何设计？引物3引物43.请通过图示展示该PCR的全过程GC引3T引2GG引3T引3T引2A√√引3T引2AGC引1C引4A√引4AC引1T引4A√引4A引1T混合引2A引1T引3T引4A引2A引1T

重叠延伸PCR技术

例题7重叠延伸PCR技术利用在需要诱变的位置合成两个带有变异基因碱基的互补引物，然后分别与引物a和引物d做PCR，这样得到的两个PCR引物产物都带有变异基因，并且彼此重叠，再将重叠部位进行重组PCR就能得到诱变PCR产物如图1．请据图回答：①图1，PCR扩增DNA的过程中，引物a、b、c、d中，PCR1应选择图1中引物_____，大量扩增突变产物AD则应选择引物_____。②重叠延伸PCR通过_______________________实现定点突变。PCR1和PCR2需要分别进行的原因是__

___。引物b和引物c可以互补配对，导致引物失效在引物b和c上引入突变a和da和b三、引物的应用3、通过设计引物，实现扩增对象末端的定点突变；4、结合重叠延伸PCR技术，可实现基因内部的突变。一、引物的作用：1、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸；2、引物的作用是使Taq酶能够从其3’端开始连接脱氧核苷酸。二、引物的设计：1、相对而言，一般引物越长，G+C比例越高，退火温度越高，扩增特异性强；2、引物自身不应存在互补配对序列（发夹结构）；两条引物之间不应存在互补配对序列。三、引物的应用：1、通过选择合适的引物，确定目的基因的正确插入反向；2、巧妙设计引物，通过反向PCR，实现对已知序列两侧的未知序列的扩增。3、通过设计引物，实现扩增对象末端的定点突变；4、结合重叠延伸PCR技术，可实现基因内部的突变。PCR中的引物课堂小结:引物相关的考察还有很多，如：1、引物的计算2、引物5’端限制酶识别位点的修饰3、实时荧光定量RT-PCR用于RNA病毒的核酸检测。。。。。。PCR中的引物课堂小结:1、目的基因测序（登录GENEBANK相关网站查找）2、根据目的基因的序列（上下游）设计引物：手动或者借助引物设计软件3、写出引物序列后，发给引物生产公司生产实践中引物这样来

希望最优秀的你将来能从事生物科学基因工程相关的研究，让我们今天的异想天开在明天成为现实，报效祖国，造福全人类！1、(2021·天津)（节选）乳酸菌是乳酸的传统生产菌,但耐酸能力较差,影响产量。酿酒酵母耐酸能力较强,但不产生乳酸。研究者将乳酸菌的乳酸脱氢酶基因(LDH)导入酿酒酵母,获得能产生乳酸的工程菌株。图为构建表达载体时所需的关键条件。

获得转基因酿酒酵母菌株的过程如下：设计引物扩增乳酸脱氢酶编码序列。为使扩增出的序列中编码起始密码子的序列由原核生物偏好的GTG转变为真核生物偏好的ATG,且能通过双酶切以正确方向插入质粒,需设计引物1和2。其中引物1的5‘端序列应考虑：

和

，，答案：包含BamHI的识别序列

将GTG改为ATG补充训练2、（2023·山东）（节选）科研人员构建了可表达J-V5融合蛋白的重组质粒并进行了检测，该质粒的部分结构如图甲所示，其中V5编码序列表达标签短肽V5。(2)构建重组质粒后，为了确定J基因连接到质粒中且插入方向正确，需进行PCR检测，若仅用一对引物，应选择图甲中的引物

。答案：(2)F2和R1或F1与R2

补充训练3、（2021山东）人类γ基因启动子上游的调控序列中含有BCL11A蛋白结合位点，该位点结合BCL11A蛋白后，γ基因的表达被抑制。通过改变该结合位点的序列，解除对γ基因表达的抑制，可对某种地中海贫血症进行基因治疗。科研人员扩增了γ基因上游不同长度的片段，将这些片段分别插入表达载体中进行转化和荧光检测，以确定BCL11A蛋白结合位点的具体位置。相关信息如图所示。回答下列问题：(1)为将扩增后的产物定向插入载体指导荧光蛋白基因表达，需在引物末端添加限制酶识别序列。据图可知，在F1～F7末端添加的序列所对应的限制酶是

，在R末端添加的序列所对应的限制酶是

。本实验中，从产物扩增到载体构建完成的整个过程共需要

种酶。(2)将构建的载体导入除去BCL11A基因的受体细胞，成功转化后，含F1～F6与R扩增产物的载体表达荧光蛋白，受体细胞有荧光，含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光。含F7与R扩增产物的受体细胞无荧光的原因是