茶叶生物技术-课件(共7单元)03第三章茶叶酶工程

一、酶（Enzyme）的概念酶是活细胞产生的一类具有催化功能的生物分子，所以又称为生物催化剂Biocatalysts。酶催化的生物化学反应，称为酶促反应Enzymaticreaction。在酶的催化下发生化学变化的物质，称为底物substrate。2H2O22H2O+O2过氧化氢酶酶的化学本质：大都是蛋白质第三章茶叶酶工程酶具有一般催化剂的特征：1.只能进行热力学上允许进行的反应；2.可以缩短化学反应到达平衡的时间，而不改变反应的平衡点；3.能加快化学反应的速度

。酶的化学本质和催化特点

一、酶的催化特点：

1、酶具有很高的催化效率

通常要高出非生物催化剂催化活性的106-1013倍。2H2O22H2O+O21mol过氧化氢酶6×106mol.s-11mol离子铁6×10-4mol.s-1

2、酶具有高度的专一性

3、酶易失活

4、酶活性受到调节和控制

二、酶的化学本质

1926年J.Sumner

脲酶结晶

1930－1936年Northrop

胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶结晶

1982年T.Cech＆Altman

“Ribozyme”，即核酶。

酶的化学本质是蛋白质的主要依据是：

（1）．酶经酸、碱水解后的最终产物是氨基酸。

（2）．酶能被蛋白酶水解而失活。

（3）．酶是具有空间结构的生物大分子，凡能使蛋白质变性的因素都可以使酶变性失活。

（4）．酶是两性电解质，各具有特定的PI。

（5）．酶是胶体溶液。

（6）．酶也有蛋白质具有的化学呈色反应。

酶单纯蛋白酶：脲酶、蛋白酶、淀粉酶、核糖核酸酶等。缀合蛋白酶酶蛋白（脱辅酶）辅因子（简单蛋白酶）

（apoenzyme）（cofacter)辅酶（coenzyme)辅基(prostheticgroup)全酶(holoenzyme）=酶蛋白+辅因子透析法能除去透析法不易除去三、酶的化学组成1、根据酶的组成，可把酶分为单纯蛋白质和缀合蛋白质两类。2、根据酶分子的结构特点，可将酶分为三类：

（1）．单体酶：由一条多肽链组成，相对分子质量在13000－35000。属于这一类的酶很少，一般是水解酶。

（2）．寡聚酶：由两个或两个以上的亚基组成，亚基间靠次级键结合，很容易分开。相对分子质量在35000－上百万。大多数寡聚酶其聚合形式是活性型，解聚形式是失活型。它们一般都是调节酶，在代谢的调节控制过程中起重要的作用。

（3）．多酶复合体：由几种或更多的酶靠非共价键彼此嵌合而成的复合体，它有利于一系列反应的连续进行。相对分子质量很大，一般在几百万以上。如丙酮酸脱氢酶复合体、脂肪酸合成酶复体。

（4）核酶

一、酶的分类1961年国际酶学委员会（EnzymeCommittee,EC）根据酶所催化的反应类型和机理，把酶分成6大类：氧化还原酶类：主要是催化氢的转移或电子传递的氧化还原反应。（1）氧化酶类：催化底物脱氢，并氧化生成H2O2或H2OAH2+O2A+BH2（H2O2，H2O）（2）脱氢酶类：催化直接从底物上脱氢的反应。AH2+BA+BH2（需辅酶Ⅰ或辅酶Ⅱ）酶的分类和命名2.转移酶类：催化化合物中某些基团的转移。A·X+BA+B·X根据X分成8个亚类：转移碳基、酮基或醛基、酰基、糖基、烃基、含氮基、含磷基和含硫基的酶。3.水解酶类：催化加水分解作用。AB+H2OAOH+BH4.裂合酶类：催化从底物移去一个基团而形成双键的反应。C—O键CH2COOHHO—CH—COOHHCCOOHHOOCCH+H2OA·BA+BC—N键COOHCH—NH2CH2COOHCOOHCHHCCOOH+NH35.异构酶：催化各种同分异构体（分子式相同而分子构造不同）之间的互变。AB常见的有醛酮异构如：丙醛和丙酮、顺反异构和变位酶类。6.合成酶类：催化有ATP参加的合成反应。A+B+ATPA·B+ADP+Pi二、国际系统分类法及酶的编号序号酶类反应性质反应通式1氧化还原酶催化氧化还原反应AH2+B↔A+BH2A3＋

+B2＋↔A2＋+B3＋2转移酶催化分子间基团转移反应AR+B↔BR+A3水解酶催化水解反应AB+H2O↔AH+BOH4裂合酶催化非水解地移去底物上的一个基团而形成双键及其逆反应AB↔B＋A5异构酶催化同分异构体相互转变的反应A↔B6合成酶催化两分子物质的相互结合并偶联ATP水解的反应A＋B＋ATP↔AB＋ADP＋PiA＋B＋ATP↔AB＋AMP＋PPi1、多酚氧化酶铜离子作为辅基，在茶叶生产的过程中，通过抑制或有序的激发PPO的活性而加工出风味迥异的各大茶产品，杨子威等研究指出PPO还与茶树的抗虫、抗旱、抗寒等抗逆性密切相关。（1）具有5-15条同工酶带，各同工酶比整个酶复合体对底物的专一性更强（2）茶叶PPO的最适pH偏酸性，一般在5.0-6.5，最适温度为30-40℃。（3）最佳底物为邻位酚，如邻苯二酚、儿茶素、联苯三酚，对间苯二酚、对苯二酚，对三酚类物质中的焦性没食子酸、没食子酸也有一定的催化作用，但对单酚类物质不起作用。

2、过氧化物酶是催化过氧化氢分解而使其他氢供体氧化并生成水的一类酶。（1）以铁卟啉为辅基，属亚铁血红素蛋白质类，分子量为50000左右，具有9-10条同工酶。（2）最适pH4.1-6.2，最适温度27-30℃（3）其作用的底物范围较广，对单酚中的酪氨酸、二酚中的儿茶素和三酚中的焦性没食子酸、没食子酸等物质均有催化作用。（4）乙烯和吲哚乙酸对POD活性有促进作用，但POD活性受CN-、S2-、羟胺和氟化物的抑制。

3、糖苷酶糖苷酶(Glycosidase)又称为糖基水解酶，是一大类催化糖苷键水解的酶，这类酶在酸存在的条件下能催化由半缩醛羟基与醇羟基反应而形成的糖苷键的断裂。（1）茶树中的糖苷是茶叶香气形成的前体物质，通常是以单糖苷和双糖苷形式存在，单糖苷以β-葡萄糖苷为主，二糖苷以β-樱草糖苷为主，而糖苷酶水解这些糖苷后生成游离态的香气成分。（2）茶树中糖苷酶种类较多，最主要的糖苷酶为β-葡萄糖苷酶和β-樱草糖苷酶，其他还有β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶等。（3）β-葡萄糖苷酶属于水解酶类，多以单体酶或二聚体形式存在，可以催化含有β-糖苷键化合物的水解反应，如水解纤维素二糖和纤维素寡糖生成葡萄糖

4、脂肪氧化酶是一种含非血红素的蛋白质，定位于叶绿体的片状结构中。（1）LOX具有很强的底物专一性，作用的底物必须是含顺,顺-1,4-戊二烯的直链脂肪酸，且对C18氢过氧化物催化效果最好，对三烯酸氢过氧化物比二烯酸的反应活性高4-10倍。（2）相对分子量为73kDa，至少存在2条同工酶，最适pH6.0-7.0，最适温度40-45℃，具有较强的耐热能力，因而在干茶样中仍可检测出部分活性。（3）可被Ca2+激活，而有机溶剂、Cu2+、Mn2+、Fe3+、Co2+等金属离子可抑制其活性，但存在浓度效应。

5、茶氨酸合成酶又称谷氨酸-乙胺合成酶，可催化由谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的反应。（1）茶氨酸合成酶在茶树根部和新梢中均有分布，尽管分布的部位不同，但其酶学性质基本相同。（2）茶氨酸合成酶在Tris-HCl缓冲液中最适pH为7.5左右。（3）酶促反应速度依赖于Mg2+浓度，而Mn2+影响较小6、儿茶素合成的关键酶儿茶素合成过程中包括苯丙氨酸解氨酶、二氢黄酮醇4-还原酶、无色花色素还原酶、花青素还原酶等多种酶，这些酶类物质将多条儿茶素代谢途径相连而形成一个复杂的网络。（1）以铁卟啉为辅基，属亚铁血红素蛋白质类，分子量为50000左右，具有9-10条同工酶。（2）最适pH4.1-6.2，最适温度27-30℃（3）其作用的底物范围较广，对单酚中的酪氨酸、二酚中的儿茶素和三酚中的焦性没食子酸、没食子酸等物质均有催化作用。（4）乙烯和吲哚乙酸对POD活性有促进作用，但POD活性受CN-、S2-、羟胺和氟化物的抑制。

7、单宁酶单宁酶因具有水解没食子酸酯类化合物生成没食子酸和葡萄糖的特性，而在茶饮料澄清工艺中发挥着重要作用。（1）单宁酶专一性强，对不含酚羟基的底物类似物不起催化作用，且底物中苯环上酚羟基的位置对其催化活性也有影响。（2）微生物所产单宁酶的最适反应温度一般为30-60°C。来源于真菌和植物的单宁酶最适pH偏酸，一般为4.0-6.0。而细菌所产单宁酶的最适pH偏中性。（3）金属离子和EDTA（乙二胺四乙酸）对不同微生物来源的单宁酶活性影响差异很大。KenjiAoki等（1976）发现Zn2+、Cu2+等金属离子以及EDTA对单宁酶活性没有明显影响，而RajakumarGS和NancySC（1983）认为Cu2+、Zn2+以及Mg2+对单宁酶具有明显的抑制作用。8、果胶酶是一类能够分解果胶的多种酶的总称。根据催化底物类型可分为果胶酯酶、果胶解聚酶和果胶裂解酶三大类。（1）果胶酯酶是指以高甲酯化果胶为底物，促使其脱去甲基基团的酶；果胶解聚酶是指在水分子参与下，断裂果胶内的多聚半乳糖醛酸的α-1,4-糖苷键的酶；（2）果胶裂解酶又称果胶反式消去酶，作用于C-4位置上断开糖苷键，同时从C-5处消去一个H原子从而产生一个不饱和产物。（3）目前市售的食品级果胶酶主要来源于黑曲霉，其产生的果胶酶酶系较为健全。

9、纤维素酶是一类能够降解纤维素生成葡萄糖的酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶（又称纤维二糖酶）3种组分。（1）内切葡聚糖酶能够水解纤维素分子内的β-1,4-糖苷键；外切葡聚糖酶可从纤维素的非还原末端水解β-1.4-糖苷键产生纤维二糖；而β-葡萄糖苷酶能够水解纤维二糖或纤维寡糖产生葡萄糖。3种组分相互协作共同完成纤维素的降解过程。（2）纤维素酶的最适pH一般为4.0-6.0，最适反应温度为40-65°C，在50-70°C较为稳定。二、酶的命名法1、习惯命名法：只取较重要的底物名称和反应类型。

（1）．根据酶作用的底物命名如水解淀粉的酶叫淀粉酶；水解蛋白质的酶叫蛋白酶。有时还加上来源以区分不同来源的同一类酶，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。（2）．根据酶催化反应的性质命名如水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶、脱氢酶等。有的酶的命名结合以上（1）、（2）原则。如苹果酸脱氢酶、氨基酸氧化酶、ATP合成酶等。2、系统命名法：包括所有底物的名称和反应类型

系统名称应当明确标明酶的底物及催化反应的性质。如有两个底物，则两个底物的名称都应标明，并用“：”将它们隔开。若底物之一是水时，则可将其略去。习惯名称系统名称催化的反应乙醇脱氢酶谷丙转氨酶乙醇：NAD＋氧化还原酶丙氨酸：α－酮戊二酸氨基转移酶乙醇＋NAD＋→乙醛＋NADH丙氨酸＋α－酮戊二酸→谷氨酸＋丙酮酸酶的系统编号：4位数字第一位：代表六大类反应类型第二位：亚类（底物作用的基团或键的特点）第三位：亚亚类（精确表示受体的性质）第四位：在亚亚类中的序号乳酸脱氢酶

EC1.1.1.27第1大类，氧化还原酶第1亚类，氧化基团CHOH第1亚亚类，受氢体为NAD+该酶在亚亚类中的编号注：前面三个编号表明酶的特性：反应性质、底物性质（键的类型）及电子或基团的受体，第四个编号用于区分不同的底物。

绝对专一性结构专一性键专一性相对专一性基团专一性

酶作用专一性

旋光异构专一性立体异构专一性几何异构专一性酶的专一性1.键专一性：只作用于一种键，而对键两端的基团无严格要求。RCOO-+ROH+H+′酯酶：R—C—O—R′+H2OOOCH2OHOHOHOH15α-葡萄糖苷酶OR+H2OOCH2OHOHOHOHOH15+ROH3.绝对专一性：只能作用于某一底物。脲酶：H2N—C—NH2+H2OO2NH3+CO22.基团专一性：要求一定的键，对键一端的基团有要求HH要求α-糖苷键，并且要求α-糖苷键的一端须有葡萄糖残基4.旋光异构专一性

例如，淀粉酶只能选择性地水解D－葡萄糖形成的1，4－糖苷键；L-氨基酸氧化酶只能催化L-氨基酸氧化；乳酸脱氢酶只对L-乳酸是专一的。5.几何异构专一性如延胡索酸水合酶只能催化延胡索酸即反－丁烯二酸水合生成苹果酸，对马来酸（顺－丁烯二酸）则不起作用；酶活力的测定

一、酶活力：

又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速率来表示。酶促反应的速率用单位时间内底物的减少量或产物的增加量来表示。V=dp/dt反应初速度Vo用哪一个速度来表示酶促反应的速度特征呢？反应初速度表示酶活力的大小即底物转化量<5%时的反应速度。产物浓度变化曲线二、酶活力的表示方法及计算P1011、酶活力单位U

酶活力单位（习惯单位U）的基本定义为：在最适条件下，一定时间内将一定量的底物转化成产物所需的酶量。据不同情况有几种酶活力单位（activityunit）或又称酶单位（enzymeunit）。在实际使用中，为方便起见，经常使用不同的酶活力单位。如：①α-淀粉酶活力单位：每小时分解1g可溶性淀粉的酶量为一个酶单位。

②胰蛋白酶：每分钟分解底物酪蛋白产生1μg酪氨酸所需的酶量。国际单位：一般用IU（Unit）表示，其定义为在最佳条件下，每分钟将1μmol底物转化为产物所需要的酶量为一个酶国际单位。

Katal

一个“Katal”单位是指在最适条件下，1秒钟内转化1mol底物所需的酶量。

Kat和IU的换算关系：1Kat=60×106IU，

1Kat=106μKat=109nKat1IU=1／60μKat=16.7nKat

在实际使用中，为方便起见，经常使用不同的酶活力单位。三、比活力（specificactivity）

酶的比活力是每单位（一般是mg）蛋白质中的酶活力单位数（如：酶单位/mg蛋白）

比活力=IU数/mg蛋白=Kat数/kg蛋白=μKat数/mg蛋白对同一种酶来说，比活力越大，表示酶的纯度越高。酶的作用机理

酶作为生物催化剂的最大特点：具有高效性、专一性、。那么酶是通过什么机制来实现这一特点的呢？酶的催化机理一、酶与活化能碰撞、有效碰撞、活化分子、活化能：分子由常态转变为活化状态所需要的能量称为活化能。也就是在一定温度下，1摩尔底物全部进入活化态所需的自由能。反应所需的活化能越高，相对活化分子就越少，反应速度就越慢。酶的作用机制

酶是一种高效催化剂，与一般催化剂比较，大大降低了反应分子所需的活化能，因此，同样初态的分子所需要的活化能就更低，活化分子数也就更多，大大加快了反应速度。举例：过氧化氢酶催化过氧化氢的分解mov酶催化机理过氧化氢酶催化过氧化氢的分解75.4KJ/mol48.9KJ/mol8.4KJ/mol酶的催化机理二、酶与底物作用机理催化机理目前较满意的解释是：中间产物学说又叫

过渡态学说酶如何降低化学反应的活化能?中间产物学说酶与底物通过形成中间产物使反应沿一个低活化能的途径进行。E+S

ESE+P酶的催化机理二、酶与底物作用机理中间产物学说酶的催化机理二、酶与底物作用机理底物S与酶E结合形成中间产物ES

S与E的结合导致分子中某些敏感的化学键发生变化，呈不稳定状态，亦即活化态，使反应活化能降低。中间产物ES不稳定，转变成酶与产物的复合物EP，EP裂解，生成产物P，这一过程使所需的活化能低Sumary-中间产物学说酶的催化机理二、酶与底物作用机理mov酶催化机理酶催化机理

中间产物学说认为：酶在催化化学反应时，酶与底物首先形成不稳定的中间物，然后分解酶与产物。即酶将原来活化能很高的反应分成两个活化能较低的反应来进行，因而加快了反应速度。

S+E→ESPE→P+E底物酶中间产物复合物产物

实验依据1.间接证据：如：用吸光法证明了含铁卟啉的过氧化物酶参加反应时，单纯的酶的吸收光谱与加入了第一个底物H2O2后确实产生了变化。2.直接证据：

过渡态中间复合物ES，是一种极不稳定的物质，寿命只有10-12秒，正常情况下是找不到的，通过低温处理（-50℃），使ES的寿命延长至2天，弹性蛋白酶切片的电镜照片以及X光衍射图都证明了ES的存在。

二、酶的活性部位酶分子上直接和底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位，这一部位就称为酶的活性中心(activecenter)。

已糖激酶的活性中心

结合部位(Bindingsite)：酶分子中与底物结合的部位或区域一般称为结合部位。催化部位(Catalyticsite):

酶分子中促使底物发生化学变化的部位称为催化部位。

通常将酶的结合部位和催化部位总称为酶的活性部位或活性中心。结合部位决定酶的专一性，催化部位决定酶所催化反应的性质。

在酶分子中有一些基团对维持酶活性中心应有的空间构象及发挥正常的催化活性是必需的，若将这些基团改变后会导致酶的催化活性减弱甚至丧失，称为必需基团。

结合基团活性中心内必需基团催化基团活性中心外必需基团：维持酶的空间构象底物活性中心外的必需基团结合基团催化基团活性中心酶活性中心的特点

酶的活性中心只有几个氨基酸组成，多为极性氨基酸。酶的活性中心形成一个能与底物结合并催化底物形成产物的，位于酶蛋白分子表面的，特定化空间区域。酶的活性中心与底物的结合通过次级键。酶的活性中心具有柔性，可与底物诱导契合发生相互作用。酶的活性中心位于酶分子表面的”空穴“中，为非极性疏水环境。三、诱导契合学说与酶的专一性(1)锁钥假说(lockandkeyhypothesis)：1894年，Fisher提出“锁与钥匙”假说，该假说认为酶表面具有特定的形状，像一把锁，底物分子或底物分子的一部分像钥匙那样，专一地插入酶的特定部位，底物分子与酶分子在结构上具有紧密的互补关系。

认为整个酶分子的天然构象是具有刚性结构的，酶表面具有特定的形状。酶与底物的结合如同一把钥匙对一把锁一样酶的催化机理

此学说很好地解释了酶的立体异构专一性，但不能解释酶的活性中心既适合于可逆反应的底物，又适合于产物，也不能解释酶专一性中的所有现象。（二）诱导契合学说(InducedfitHypothesis)1958年D.E.Koshland提出酶分子活性中心的结构原来并非和底物的结构互相吻合，但酶的活性中心是柔性的而非刚性的。酶的催化机理

当底物与酶相遇时，可诱导酶活性中心的构象发生相应的变化，其上有关的各个基团达到正确的排列和定向，因而使底物和酶能完全契合。当反应结束产物从酶分子上脱落下来后，酶的活性中心又恢复成原来的构象。二、酶与底物作用机理酶的催化机理

二、酶与底物作用机理四、影响酶催化效率的因素1、底物与酶的邻近效应和定向效应2、底物分子的形变和诱导契合3、酸碱催化4、共价催化5.金属离子的作用6.活性部位的微环境的影响对于双分子反应，底物结合到酶的活性中心两个底物分子相邻近，大大提高了底物的有效浓度——邻近效应底物分子还在活性中心“定向”排布，有利于原子轨道的重叠——轨道定向，使分子间反应近似于分子内反应

四、酶催化的高效性的机理酶催化的高效性1.邻近效应和定向效应酶AB邻近效应与定向作用（proximityeffect&orientationarrange）酶将2个底物拉近，以准确的方向碰撞。实际上是将分子间的反应变成类似于分子内的反应2、“张力”和“形变”：底物与酶结合诱导酶的分子构象变化，变化的酶分子又使底物分子的敏感键产生“张力”甚至“形变”，从而促使酶－底物中间产物进入过渡态。3、酸碱催化：狭义的酸-碱催化：H+和OH-的催化广义的酸-碱催化：化学上把酸定义为质子的供体，碱定义为质子的受体。质子受体和质子供体形成的酸碱催化。酶参与的酸-碱催化反应一般都是广义的酸－碱催化方式。细胞内的酸碱催化是指组成酶活性中心的氨基酸的侧链基团，在底物的变化中起质子的供体或受体的作用，达到降低反应活化能的过程，从而加快反应的速度。具有酸碱催化特征的酶促反应，酶与底物结合成的中间产物是离子型络合物。举例：His残基的咪唑基是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。His是酶的酸碱催化作用中最活泼的一个催化功能团。(pK=6)半寿期小于10

10秒酸碱催化His57

4、共价催化：1）酶活性中心亲电基团或亲核基团分别吸取电子或放出电子作用于底物的缺电子中心，迅速形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。2）亲电基团(电子受体)——H+、Mg2+、Mn2+、Fe2+、羰基碳原子（有空轨道）；亲核（亲质子）基团(电子供体)——OH、SH、咪唑基（带负电荷）亲核基团亲电子的基团

—CH2—OH

丝氨酸羟基

—CH2

—SH

半胱氨酸巯基

—CH2—C=CHHNNCH

组氨酸咪唑基蛋白质中三种主要的亲核基团共价催化His57酶活性中心处于一个非极性环境中，从而有利于同底物的结合。（能够减弱极性基团间的相互作用。）5.微环境的影响（酶活性中心是低介电区域）結合区可避免水分子干扰在避開水分子的干扰下，分子間的离子键才容易產生。-+小结

酶与底物结合时，由于酶的变形（诱导契合）或底物变形（张力学说）使二者相互结合，并依靠离子键、氢键、范德华力的作用和水的影响，结合为中间产物，在酶分子的非极性区域内，由于酶与底物的邻近，定向，使二者可以通过亲核\亲电催化、酸碱催化方式进行的多元催化，从而大大降低反应所需的活化能，使酶促反应迅速进行。第2节茶叶酶的来源与生产1茶产业中重要酶的来源名称来源多酚氧化酶E.C.1.10.3.1茶叶、梨等植物单宁酶E.C.3.1.1.20黑曲霉、黄曲霉、米曲霉果胶酶E.C.3.2.1.15绿色木霉其及其近缘的菌株纤维素酶E.C.3.2.1.4黑曲霉、青霉、根霉、木霉β-葡萄糖苷酶黑曲霉木瓜蛋白酶E.C.3.4.22.2木瓜蛋白酶E.C.3.4.22.4

菠萝一个良好的产酶菌种应具备以下几个条件：（1）菌株安全，不是致病菌，不产生有毒物质或是其他生理活性物质，以保证茶叶酶的生产和应用的安全；（2）菌株不易变异和退化，产酶性能稳定；（3）不易感染噬菌体；（4）微生物繁殖快，产酶量高；（5）酶的性质符合应用的需要，最好是胞外酶；（6）产生的酶便于分离和提取，得率高；（7）微生物的营养要求低。2茶产业中酶的发酵生产酶的发酵生产是在人工控制的条件下，有目的的通过大规模培养微生物，以获得微生物合成的酶，主要包括培养基制备、发酵方式的选择与优化等方面。（1）培养基制备培养基为微生物的生长、繁殖、代谢及酶的生产提供所必须的营养物质。水、碳源、氮源、无机盐和生长素是培养基的五要素，这些成分的比例并不是一成不变的，可根据菌种的更新、发酵条件的变化而做出相应的调整。a.在酶的发酵生产中所用的水一般为自来水b.考虑原料价格以及来源，通常使用农副产物、各种淀粉以及水解物作为碳源。c.蛋白胨、豆饼、花生饼粉、鱼粉等农副产物是常用的有机氮源，而常用的无机氮源主要为硫酸铵和尿素。氮源的选择因微生物菌种以及酶蛋白的不同而异，如利用绿色木霉生产纤维素酶时，因有机氮促进菌体的生长繁殖而不利于纤维素酶的合成，应选用硫酸铵等无机氮作为其氮源。d.无机盐在微生物发酵生产中具有浓度效应，即低浓度的无机盐有利于提高酶产量，而高浓度则会抑制生产。e.生长因子是微生物代谢活动所必须的微量有机物，包括维生素、氨基酸、嘌呤碱等构成辅酶所必须的物质。大部分的生长因子是酶蛋白的诱导物或是表面活性剂。pH值也是培养基制备过程中需要着重考虑的一个因素，霉菌、酵母菌偏好微酸性的环境，而多数的细菌、放线菌适合在中性至微碱性的环境中生长。（2）酶的发酵生产方式多酚氧化酶多是通过植物材料中分离纯化获得，其他酶类多是由微生物发酵制备的。主要有固体发酵和液体深层发酵两种。固体发酵法是指在固体、半固体或富含营养物质的惰性载体上培养微生物和生产酶的一种方法。固体发酵接近于微生物的生长环境而有利于菌株生长与酶的合成，后期的酶蛋白提取方便，有的甚至不需要提取，直接作为粗酶制剂。与液体发酵相比，在发酵过程中固体发酵不产生废水，一定程度上减少了环境污染。此外，培养基多使用麸皮、米糠等农副产品，来源广泛，可选择性大。虽然固体发酵方式较为简便，但操作条件不易控制、易染菌、缺乏高效的发酵反应器是制约其发展的瓶颈。液体深层发酵法是以液体培养基为原料进行的微生物繁殖和产酶的方法。液体发酵的条件较好控制，不易污染杂菌，生产效率较高，且能随时检测酶活力，成为现在多数酶蛋白的发酵生产方式。根据操作方式，液体深层发酵可分为分批培养、补料分批培养及连续培养。分批培养一次投放、一次产出，操作简单且不易染菌，是最常用的发酵方式，但是分批培养发酵的时间较短、生产效率低。连续培养产酶的时间长，但是极易染菌。补料分批发酵介于二者之间，是工业普遍使用的液体发酵方式。相对于固态发酵，液态发酵技术成熟，但其存在酶蛋白浓度低、需要浓缩处理、分离提取困难、耗能大、产生废液等缺点。（3）酶的发酵条件优化酶的发酵条件优化是指在已有的常规菌种或基因工程菌的基础上，通过对生物反应器操作条件的改进，或发酵设备的选型改造，以降低生产成本，提高酶生产能力和产品质量。发酵温度、pH、溶氧量是影响微生物生长以及分泌酶蛋白的重要因素，在发酵生产过程中进行适度调整是提高酶产量及其品质的重要措施。微生物在低于最适温度时生长缓慢，产酶能力低；而过高的发酵温度又会导致细胞热休克，细胞内产生大量蛋白酶而使目的酶蛋白的产量下降。一般情况下，微生物发酵初期需要保温，在生长过程中则需要降低发酵温度。发酵温度的选定，需结合菌种特性、发酵方式等进行优化。pH是另一影响微生物产酶的因素。微生物新陈代谢的过程中不断产生代谢产物并释放到培养基中，而使发酵培养基中pH发生改变。因此发酵过程需要对培养基的pH值进行监测，并根据监测结果进行调整。溶解氧浓度是影响发酵效果的又一重要因素。多数产酶微生物为好氧微生物，需要在溶解有大量氧气的培养基中生产。由于氧气微溶于水，因此在生产过程中必须以无菌空气的形式向培养基中通气以满足微生物生长需要。但如果直接向发酵罐中通气又会产生气泡，因而发酵过程中不仅需要监测发酵液的溶解氧水平，还需适时对气泡进行消除处理。此外，培养基的C/N比、生长因子、湿度等也是影响微生物产酶的重要因素。对于诱导酶的发酵生产，还需在发酵培养基中添加诱导物以促进产量，如纤维素二糖可作为纤维素酶的诱导物，提高其产量。第3节茶叶酶的分离纯化细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。胞内酶胞外酶1.酶的分离纯化策略2.细胞破碎3.酶的提取4.酶的分离方法5.酶的浓缩、干燥与结晶1、酶的分离纯化策略1、基本原则1）首要原则：防止酶变性失活2）预防蛋白质变性的方法和措施：（1）所有操作应在低温下进行。（2）pH合适。（3）减少泡沫产生。（4）加少量重金属螯合剂。（5）添加特异性物质，采用亲和层析方法。（6）减少微生物及杂蛋白的存在。（7）适当添加其他抑制蛋白质降解的试剂。2、

细胞破碎通过各种方法使细胞外层结构破坏的技术过程。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿、表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理一种从植物中提取超氧物歧化酶的方法：ａ．称取，加入0.05mol/LＫ2ＨPO4溶液，捣碎匀浆，并压榨过滤；ｂ．滤液中加入1/4体积4:4的乙醇:氯仿混合溶液，搅拌均匀，2000rpm离心20分钟；ｃ．取上清液按15g/L加入K2HPO4搅匀，再加入0.6体积的丙酮，2000rpm离心20分钟；ｄ．取上清液，加入1体积的丙酮，2200rpm离心20分钟；ｅ．弃上清液，沉淀溶于于3mmol/L的磷酸缓冲液（pH7.5）中，并透析；ｆ．透析液用Sephadex-G75或G100进行凝胶过滤，收集活性部分。方法举例霉菌：较容易，通过机械剪切、研磨或者加入细胞壁溶解酶。细菌：少量采用超声波破碎和溶菌酶处理，大量用丙酮干粉法，或用自溶法。酵母菌：细胞壁溶解酶处理法、稀盐溶液振荡法、冷热破壁法。酶的提取：也称为酶的抽提，指在一定的条件下，用适当的溶剂或溶液处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂或溶液中的过程。提取目标：将目的酶最大限度地溶解出来。保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但要防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则：相似相溶。远离等电点的pH值，溶解度增加。酶的提取提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂用于提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶1、酶的主要提取方法2、影响酶提取的主要因素1）温度2）pH值3）提取液的体积酶的分离方法1、沉淀分离（溶解度）2、离心分离（分子量，密度）3、过滤与膜分离（分子大小、形状）4、层析分离（分子形状、大小、分子量、电荷、吸附力等）5、电泳分离（电荷、分子量）6、萃取分离（溶解度）1、沉淀分离

通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法（中性盐沉淀）利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离。等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离。复合沉淀法（有机聚合物沉淀）在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离。选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离。（1）盐析沉淀法（改变离子强度）盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。常用的中性盐：硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等。其中以硫酸铵最为常用。硫酸铵优点：这是由于硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小，不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。缺点：缓冲能力较差，铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其它中性盐进行盐析。在盐析时，溶液中硫酸铵的浓度通常以饱和度表示。

溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的总体积（2）等电点沉淀（isoelectricprecipitation）

原理：蛋白质在等电点时溶解度最低；不同的蛋白质具有不同的等电点。使用方法：单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。（3）有机溶剂沉淀法（降低介电常数）有机溶剂沉淀原理：主要是由于有机溶剂的存在会使溶液的介电常数降低。例如，20℃时水的介电常数为80，而82％乙醇水溶液的介电常数为40。溶液的介电常数降低，就使溶质分子间的静电引力增大，互相吸引而易于凝集，同时，对于具有水膜的分子来说，有机溶剂与水互相作用，使溶质分子表面的水膜破坏，也使其溶解度降低而沉淀析出。常用的有机溶剂：丙酮、乙醇、甲醇、异丙醇等（2倍，70%）优缺点：优点：

1）分辨率比盐析法高。

2）沉淀不需脱盐。

3）溶剂易蒸发，沉淀易离心。缺点：

1）容易引起蛋白质变性失活。

2）有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。影响有机溶剂沉淀的因素（1）温度：低温（0℃）操作。（2）pH值：尽可能靠近其等电点。（3）离子强度：采用<0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度目的防止蛋白质变性（4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml（4）复合沉淀法（有机聚合物沉淀法）原理：与有机溶剂类似

。沉淀剂：多用聚乙二醇。优点：①操作条件温和，不易引起生物大分子变性。②沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相当多的生物大分子。③沉淀后有机聚合物容易去除。（5）选择性变性沉淀法定义：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白质变性沉淀而不影响所需蛋白质的方法。方法：①热变性几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固，加热升高温度使杂蛋白变性沉淀而保留目的物在溶液中。②pH变性等电点沉淀法是pH变性法中的一种变体。③有机溶剂变性使那些对有机溶剂敏感的杂蛋白变性沉淀。2、离心分离离心分离：借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小、不同密度的物质分离的技术过程。在离心分离时，要根据欲分离物质以及杂质的颗粒大小、密度和特性的不同，选择适当的离心机、离心方法和离心条件。（1）离心机的选择名称转速(r/min)注意事项酶分离纯化中的用途低速离心机

6000常温，注意样品热变性和离心管平衡细胞、细胞碎片和培养基残渣等固形物的分离高速离心机6000〜25000冷冻（防止温度升高），离心管的精确平衡沉淀细胞碎片和细胞器等超速离心机>25000冷冻＋真空系统（减少空气阻力和摩擦），离心管的精确平衡DNA、RNA、蛋白质等生物大分子以及细胞器、病毒等的分离纯化离心机操作平衡、定温、定速、定时。（2）离心方法的选择

差速离心法沉降速度法密度梯度离心沉降平衡法等密度梯度离心①差速离心（differentialcentrifugation）定义：采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。特点：用于分离大小和密度差异较大的颗粒。优点：操作简单。缺点：1）分离效果较差，不能一次得到纯颗粒。

2）壁效应严重。

3）沉降的颗粒受到挤压。②密度梯度离心（densitygradientcentrifugation）定义：样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的组分得以分离的一种区带分离方法。常用密度梯度溶液：蔗糖溶液。特点：

1）区带内的液相介质密度小于样品物质颗粒的密度。

2）适宜分离密度相近而大小不同的固相物质。③等密度梯度离心定义：又称沉降平衡离心（sedimentationequilibriumcentrifugation）。根据颗粒的密度不同而进行分离。离心时，在离心介质的密度梯度范围内，不同密度的物质颗粒或向下沉降，或向上漂浮，达到与其相同的密度时不再移动，形成区带。

常用梯度介质：氯化铯溶液。特点：

1）介质的密度梯度范围包括所有待分离物质的密度。

2）适于分离沉降系数相近，但密度不同的物质。密度梯度离心等密度梯度离心梯度介质通常用蔗糖最大的梯度密度<最小密度的沉降样品通常用CsCl最大的梯度密度>密度最大的沉降样品离心条件在最前的沉降物质达到管底前停止，短时间，低速度使各组分沉降到其平衡的密度区，长时间，高速度分离依据密度相近，但沉降系数不同沉降系数相近，但密度不同沉降速度离心和沉降平衡离心的特点过滤非膜过滤：采用高分子膜以外的物质作为过滤介质膜过滤：采用各种高分子膜为过滤介质3、过滤与膜分离过滤是借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程。类别截留颗粒大小截留的主要物质过滤介质粗滤>2μm酵母、霉菌、动物细胞、植物细胞、固形物等滤纸、滤布、纤维、多孔陶瓷、烧结金属等微滤0.2～2μm细菌、灰尘等微滤膜、微孔陶瓷超滤20Å～0.2μm病毒、生物大分子等超滤膜反渗透<20Å生物小分子、盐、离子反渗透膜过滤的分类及其特性

(根据过滤介质截留的物质颗粒大小不同)膜分离加压膜分离微滤超滤反渗透电场膜分离电渗析离子交换膜电渗析扩散膜分离透析纳滤（NF，Nanofiltration）：是一种介于反渗透和超滤之间的压力驱动膜分离过程，流体静压差电场正负极小分子扩散颗粒大小膜四种常用膜分离过程的截留特性根据膜材料和不同进料液的特性，商品应用的膜产品通常采取如下几种结构形式：管式；中空纤维；卷式；平板式。4、层析分离层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流过此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。分子的大小和形状分子极性吸附力分子亲和力分配系数……层析法的分类按两相所处的状态分类：按操作形式分类：按层析过程机理分类：液相层析液-固层析液-液层析气相层析气-固层析气-液层析柱层析纸层析薄层层析

层析方法分离依据吸附层析吸附力分配层析分配系数离子交换层析离子交换凝胶层析相对分子质量与形状亲和层析亲和力层析聚焦等电点疏水层析疏水作用层析分离方法1）吸附层析（adsorptionchromatography）是利用吸附剂对不同物质的吸附力不同而使混合物中各组分分离的方法。吸附层析是各种层析技术中应用最早的技术。吸附剂来源丰富、价格低廉、可再生，吸附设备简单。吸附：被吸附物吸附到吸附剂的表面上。解吸：被吸附物离开吸附剂表面。

吸附层析通常采用柱型装置，将吸附剂装在吸附柱中，装置成吸附层析柱。层析时，欲分离的混合溶液自柱顶加入，当样品液全部进入吸附层析柱后，再加入洗脱剂解吸洗脱。在洗脱时，层析柱内不断发生解吸、吸附、再解吸、再吸附的过程。溶剂洗脱法：采用单一或混合的溶剂进行洗脱的方法。置换洗脱法：采用置换洗脱液进行洗脱的方法。置换洗脱液：含有一种吸附力比被吸附组分更强的溶液。前缘洗脱法：又称前缘分析法，连续向吸附层析柱中加入欲分离的混合溶液。分配层析是利用各组分在两相中的分配系数不同，而使各组分分离的方法。分配系数：指一种溶质在两种互不相溶的溶剂中溶解达到平衡时，该溶质在两项溶剂中的浓度的比值。在层析条件确定后，分配系数是一常数。纸上层析分配薄层层析分配气相层析2）分配层析利用离子交换剂上的可解离基团（活性基团）对各种离子的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。3）离子交换层析（ionexchangechromatography，IEC）

按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交换剂。由于酶分子具有两性性质，所以可用阳离子交换剂，也可用阴离子交换剂进行酶的分离纯化。

阴离子交换剂(可吸附带负电的蛋白质)

阳离子交换剂(可吸附带正电的蛋白质)两种离子交换剂阴离子交换剂：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羟丙基阳离子交换剂：常用羧甲基CM—CH2COO－

磺丙基SP—C3H6SO3－DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3离子交换层析Ion-exchangechromatography凝胶层析又称为凝胶过滤，分子排阻层析，分子筛层析等。是指以各种多孔凝胶为固定相，利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术。4）凝胶层析Size-exclusionchromatography酶分离纯化的方法1、沉淀分离2、离心分离3、过滤与膜分离4、层析分离盐析沉淀法等电点沉淀法有机溶剂沉淀法复合沉淀法选择性变性沉淀法差速离心密度梯度离心等密度梯度离心粗滤微滤超滤纳滤反渗透吸附层析分配层析离子交换层析凝胶层析亲和层析层析聚焦凝胶对溶质的排阻程度可用分配系数Kd表示：

Ve-VoKd=————ViVo——外水体积，层析柱内凝胶颗粒之间空隙的体积（ml）Vi——内水体积，层析柱内凝胶颗粒内部各微孔体积的总和（ml）Ve——某组分的洗脱体积，从加进层析柱到流出液中该组分出现高峰时的洗脱液体积（ml）凝胶过滤柱色谱洗脱的三种峰Ⅰ.Kd=0时,即Ve=Vo,说明该组分分子量足够大，不进入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1时,即Ve=Vo+Vi，说明该组分能进入凝胶的全部内空隙，最后流出。Ⅲ.其它组分0<Kd<1,因分子大小而改变洗脱峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。Ve-VoKd=————Vi

分配系数Kd的意义：1)可定量地衡量各组分的流出顺序。2)判断分离效果，Kd差异大，分离效果好，

Kd差异小，分离效果差。常用的凝胶：

葡聚糖凝胶 琼脂凝胶与琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶

凝胶型号颗粒大小/μm溶胀体积/(ml/g)分离范围（Mr）SephadexG-10SephadexG-15SephadexG-25SephadexG-50SephadexG-75SephadexG-100SephadexG-150SephadexG-2004～1204～12050～15050～15040～12040～12040～12040～1202～32.5～3.54～69～1112～1515～2020～3020～30小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

型号使用范围（蛋白质的分子量）含琼脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～1500001086421类型说明功能基反离子DEAE-SephadexA-25，A-50弱碱性阴离子交换剂二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25，A-50强碱性阴离子交换剂二乙氨基己基——2-羟丙基氯CM-SephadexC-25，C-50弱酸性阳离子交换剂羧甲基钠SP-SephadexC-25，C-50强酸性阳离子交换剂磺丙基钠离子交换葡聚糖5）亲和层析亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力，而使生物分子分离纯化的技术。酶与底物，酶与竞争性抑制剂，酶与辅助因子，抗原与抗体，酶RNA与互补的RNA分子或片段，RNA与互补的DNA分子或片段等亲和层析亲和层析的四个要素根据欲分离组分与配基的结合特性，亲和层析可以分为：共价亲和层析疏水层析金属离子亲和层析免疫亲和层析染料亲和层析凝集素亲和层析生物大分子中的功能基团与配基形成可逆共价键酶蛋白与配基发生疏水结合酶蛋白表面的某些氨基酸残基与金属离子亲和结合抗原与抗体的特异结合需要核苷酸类物质的某些辅酶与有些染料特异结合凝集素能与糖蛋白的残基专一而又可逆结合6）层析聚焦（chromatofocusing）层析聚焦：将酶等两性物质的