（高清版）DB51∕T 1546-2012 植物检疫实验室常规检验技术 真菌　

DB51DB51/T1546—2012植物检疫实验室常规检验技术真菌2012-12-20发布2013-03-01实施四川省质量技术监督局发布I前言 12规范性引用文件 13术语和定义 1 25试剂与材料 26仪器与用具 27取样及送样要求 28检测方法 39结果判定 3附录A(资料性附录)真菌病害主要症状特征 4附录B(资料性附录)真菌病害显微镜检查 6附录C(资料性附录)真菌病害染色检验 7附录D(资料性附录)真菌病害分离培养检验 8本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则进行编写。本标准由四川省农业厅提出并归口。本标准由四川省质量技术监督局发布。本标准起草单位：四川省农业厅植物检疫站。本标准主要起草人：宁红、李小松、刘可、赵兰鸰、帅波、黄玲、熊玉兰、杨重渝、袁曦。1植物检疫实验室常规检验技术真菌件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。3.1病原真菌plantpathogenicfungi植株受病原菌侵染后，内部生理活动和外观上的生长发育呈现出某种异常状态。病原菌在植物受害部位产生的结构特征。3.4菌丝和菌丝体hyphaan真菌的典型营养体，通常呈丝状，单根的叫菌丝，菌丝的集合体叫菌丝体。真菌产生孢子的结构，如子囊果、担子果、分生孢子器、分生孢子盘、子座等，统称为子实体。23.9柯赫氏法则Koch'sRule如发现一种不熟悉的或新的病害时，应按柯赫氏法则的四个步骤来完成对具有典型症状的真菌病害，可根据特有的症状和镜检观察菌丝及孢子形态进行鉴定；对症状不行鉴定；对通过分离培养仍不能确定病原菌的病害，需按照柯赫氏法则进行鉴定。——乳酚油(苯酚结晶20mL,乳酸20mL,甘油40mL,蒸馏水20mL)——酒精(70%、95%)——龙胆紫(0.04%)——酒精冰醋酸混合液(95%酒精20mL,冰醋酸20mL)——苯胺蓝水溶液(苯胺蓝0.1g,蒸馏水100mL)—水合氯醛水溶液(水合氯醛5g,蒸馏水2mL)——升汞水溶液(升汞1g,浓盐酸2.5mL,蒸馏水1000mL)——福尔马林醋酸酒精固定液(FAA)(95%酒精20mL,福尔马林5mL,冰醋酸5mL,蒸馏显微镜、扩大镜、超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、培养皿、三角瓶、载玻片(盖玻片)、调运检疫样品按照GB15569-2009附录D和E相关规定进行取样，产地检疫样品按照各种检疫性在调运检疫和产地检疫过程中，采集具有可疑症状的叶片、枝3在保证不腐烂的前提下及时送检。8检测方法8.1症状观察观察样品有无异样，初步判断是否具有真菌病害的表现特征(见附录A),持扩大镜观察感病植株症状，检查有无孢子或子实体等病征。8.2显微镜检查见附录B。8.3染色检验见附录C。8.4保湿培养在灭菌培养皿内放入灭菌滤纸数张，吸足无菌水，上面放两根细玻棒，将表面消毒或用消毒解剖刀切取的培养物放在玻棒上，置于25℃~28℃恒温箱中培养一定时间，待培养物长出菌丝或子实体进行镜检鉴定。8.5分离培养见附录D。8.6柯赫氏法则鉴定将分离得到的纯培养物制成孢子(或菌丝)悬浮液，通过喷雾、涂抹或针刺的方法将病原菌接种到相同品种的健株上，保湿约24h~48h,诱发寄主发病。然后再从接种发病的植株上再次分离得到其纯培养物，比较接种物与纯培养物性状。9结果判定9.1通过症状观察，符合某种病害的典型症状描述特征，并结合病原菌镜检结果，可判定为该类病害。9.2根据染色检验、保湿培养或分离培养，镜检观察病原菌的形态学特征，符合某种病害的病原菌特征，可判定为该类病害。9.3采用柯赫氏法则判定，如寄主在接种后产生与原发病害一致的典型症状，并能从典型症状上再次分离到与接种物性状一致的病原菌，根据病原菌形态学特征，可判定为该类病害。4(资料性附录)花、果、叶及嫩枝上覆盖白色粉状物，后期在白粉物上出现散生状针头大的颗粒，颗粒由白变黄，最后变黑。叶、枝、果实表面覆盖一层煤烟状物，用手容易擦掉，这种病害的发生通常与蚜虫和植物受害部位变大或缩小，生长不匀，失去原来形状，后期在受害部位出现病征。发生在枝干皮层，病斑形状有圆形、近圆形、长形，通常病斑周围稍隆起，中间组织干裂，后期常产生小黑点或盘状物。A.10腐朽5发生在乔灌木的枝干或根部木质部，使木质部变质、变色、腐朽，树干内因木质部腐朽出现空洞，受害部位表面后期往往出现大型真菌繁殖体，如木耳、蘑菇或马蹄状等各种形状繁殖体。A.11腐烂分为湿腐和干腐。多汁部位破坏解体后产生湿腐或软腐症状；含水量低的植物组织软硬部位病死后产生的组织死亡称为干腐，在枝干上常与溃疡相似。A.12猝倒和立枯大多出现在播种育苗的苗木上。小幼苗根茎部发生腐烂使植物猝然倒伏，由于发生过程迅速，地上部分仍维持正常状态，称为猝倒；若幼苗根茎已木质化，茎部腐烂后不倒伏，地上叶子干枯，称为立枯。6(资料性附录)真菌病害显微镜检查B.1菌丝体和子实体的挑取检视显微镜下检视，常用浮载剂有蒸馏水、乳酚油和甘油乳酸等。检查叶片表面的真菌(如白粉菌、锈菌或其它霉菌等),采用粘贴检视的方法。将小段透明胶带粘贴在有真菌生长部位的叶面上，将胶带取下放在载玻片上的一滴甘油乳酸中，上面再加一滴甘油乳酸，加盖玻片进行检视。将小块病组织放在等量的酒精冰醋酸混合液中固定24h,再浸在饱和的水合氯醛水溶液中，待组织透明后取出用水洗净，经稀苯胺蓝水溶液染色，用甘油乳酸作浮载剂镜检。选择软硬适中的植物器官或组织为材料，直5mm²。对于柔嫩的器官组织(如幼叶),可夹在通草、木髓和胡萝卜中进行切片。切片前先准备好一个盛有清水的培养皿；切片时用左手的拇指、食指与中指捏住材料，使材料突材料和刀片的湿润。7(资料性附录)挑取少量菌丝置于载玻片上，用加有0.1%苯胺蓝的乳酚油作浮载剂，将载玻片微微加热，盖上盖玻片，显微镜观察真菌孢子或菌丝隔膜。如果染色太深，可用未加染料的染色25min~45min,用水冲洗后制片观察。8D.1.1.2马铃薯葡萄糖琼胶培养基葡萄糖(或蔗糖)10g在1000mL沸水中，加琼胶熔化后根据需要分装灭菌保存。D.1.2.2马铃薯葡萄糖琼胶培将洗净后去皮的马铃薯切碎，加水1000mL煮沸半小时，用纱布滤去马铃薯，加水补足1000mL,然后加糖和琼胶，加热使琼胶完全熔化后，趁热用纱布过滤，根据需要分装三角瓶或试管灭菌保存。D.1.2.3燕麦片琼胶培养基制备方法将燕麦片加水1000mL,在沸水浴上加热1h,纱布过滤后加水补足1000mL,加琼胶熔化后根据需打开超净工作台通风20min以上，用70%酒精擦拭手、台面和工作台出风口进行消毒，分离培养所需的用具用95%酒精擦拭后用火焰灼烧灭菌。9D.2.2.1叶斑病害——从病健交界处切取边长约5mm的小块病组织备用。D.2.2.2维管束组织病害——小材料可参照D.2.2.1,大材料可参照D.2.2.2。——取整粒种子或种子的一部分备用。将培养基加热融化，取出摇匀，在超净工作台上经无菌操作将培养基倒入已灭菌的培养皿中，厚度2mm~3mm,摇匀，静置冷却。可在10mL培养基中加入3滴25%乳酸，或加入40ug/mL链霉素防将分离的材料置于已灭菌的培养皿内，先在70%酒精中浸2s~3s,再放入0.1%升汞溶液处理30s~10min(根据材料大小、坚实程度不同有所差异),再用灭菌水清洗3～4次，用灭菌滤纸