TAHFS 006-2024 食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测（聚合酶螺旋反应法PSR）

ICS07.100.30CCSC50团 体 标 准T/AHFS006-2024速检测（聚合酶螺旋反应法，PSR）安徽省品学技术会 发布安徽省品学技术会 发布2024-10-19实施2024-09-19发布T/AHFS006-2024T/AHFS006-2024II前 言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本文件由安徽国泰众信检测技术有限公司提出。本文件由安徽省食品科学技术学会归口管理。T/AHFS006-2024T/AHFS006-2024PAGEPAGE1食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测（聚合酶螺旋反应法，PSR）本文件规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的聚合酶螺旋反应（PSR）快速检测方法。本文件适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的快速检测。GB4789.10GB4789.30食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验GB19489GB/T27403下列术语和定义适用于本文件。（Polymerasespiralreaction，PSR)2～4BstDNA20dNTPBstDNA25下列缩略语适用于本文件：DNA：脱氧核糖核苷酸（deoxyribonucleicacid）dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxyribonucleosidetriphosphate）Tris：三羟甲基氨基甲烷[tris(hydroxymethyl)aminomethane]HNB：羟基萘酚蓝（hydroxynaphtholblue）DNA1μL2ng-100恒温65℃下反应30-60minDNABstDNA5'→3'dNTPs析6.1冰箱：冷藏温度（2℃-4℃）、冷冻温度（-20℃）。6.2培养箱：36℃±1℃。(37℃)。PCR仪。0.5μL-10、0.1μL-2.5μL、10μL-100μL。表1质控菌株序号菌株名称拉丁文菌株编号备注1单核细胞增生李斯特氏菌ListeriamonocytogenesCICC21635阳性菌株2金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusCICC21600阳性菌株3大肠杆菌O157:H7EscherichiacoliCICC21530阴性菌株4蜡样芽孢杆菌BacilluscereusCMCC63301阴性菌株5肠炎沙门氏菌SalmonellaenteritidisCICC21482阴性菌株6鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumCICC21483阴性菌株7福氏志贺菌ShigellaflexneriCMCC51571阴性菌株8副溶血性弧菌VibrioparahemolyticusCICC21528阴性菌株9创伤弧菌VibriovulnificusATCC27562阴性菌株（-20）IsothermalmMmMmMmM硫酸镁和1%Tween20）（100mM，RG）；dNTP（10mM）；（5M，RG）；Bst2.0WarmStart®DNA（8,000U/mL）；Evegreen（20×）（3细菌DNA提取试剂盒，包括细菌DNA提取试剂、溶菌酶、RNase和蛋白酶K。食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的PSR快速检测程序，见图1。图1食品中单核细胞增生李斯特氏菌和金黄色葡萄球菌的PSR快速检测程序图将质控菌株富集为菌悬液并直接提取核酸，核酸浓度为20ng/μL-100ng/μL。参照国标GB4789.30取样方法，取25g（mL）待测样品，并将其置于盛有225mL的共增菌培养基（附录B）的锥形瓶中，在36℃±1℃，180rpm条件下培养8h-18h。180μL20mg/mL37℃30。DNADNADNA2（Bt、IB可提前以2：1的比例混合使用。）hlyA（IFnuc和加、IB）（A.2）表2恒温扩增体系添加顺序组分及工作浓度终浓度添加量1Isothermalbuffer（10×）1×2.5μL2甜菜碱（5M）1.2M6μL3dNTP（10mM）2mM5μL4MgSO4（100mM）6mM1.5μL5Ft和Bt（50μM）各0.64μM各0.25μL6IF和IB（50μM）各0.32μM各0.125μL7Bst2.0WarmStart®DNA聚合酶（8,000U/mL）320U/mL1μL8DNA-2μL9H2O-补齐至25μL10EveGreen（20×）/HNB(3mM)-1μL65℃金属浴反应45min，再在85℃下反应2min（使酶灭活），即可完成扩增反应。使用实时荧光定量PCR仪检测荧光信号。604545min（）；85℃2min（）在三个平行中任意一个反应孔有S型扩增曲线则判定为阳性，即该样本中含有对应检测项目的核酸；没有扩增曲线则判定为阴性，即该样本不含有对应检测项目的核酸。将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测。1%琼脂糖凝胶配置方法：称取0.4g琼脂糖，并用40mL的1×TAE30μL4SGreenPlus13检测过程中分别设三个空白对照、阴性对照、阳性对照。空白对照以灭菌水替代DNA模板；阴性对照为非目标菌DNA提取物或试剂盒内的阴性对照；阳性对照为目标菌DNA模板。以下条件有一条不满足时，实验视为无效：454545结果为阳性，表述为“单核细胞增生李斯特氏菌/金黄色葡萄球菌初筛阳性”，阳性样本按GB4789.10GB4789.30GB19489GB/T27403附录A（规范性）聚合酶螺旋扩增反应试剂组分和存放条件DNA表A.1细菌DNA提取试剂盒组分及存放条件序号名称存放条件1细菌DNA提取试剂盒常温2溶菌酶-20℃3RNase-20℃4蛋白酶K-20℃表A.2聚合酶螺旋扩增反应试剂盒成分及存放条件序号名称存放条件备注1荧光恒温扩增预混液-20℃Isothermalbuffer、甜菜碱、dNTP、MgSO4等2阳性对照-20℃目标致病菌对应的模板DNA3阴性对照-20℃非目标致病菌对应的模板DNA4空白对照-20℃灭菌去离子水5颜色指示剂4℃羟基萘酚蓝表A.3聚合酶螺旋扩增所使用的引物混合固定体系组分保存浓度存放条件终浓度添加量Ft主要引物50μM-20℃0.64μM0.25μLBt主要引物50μM-20℃0.64μM0.25μLIF加速引物50μM-20℃0.32μM0.125μLIB加速引物50μM-20℃0.32μM0.125μL表A.4聚合酶螺旋扩增反应所使用的引物序列物种目标基因引物名称序列5’-3’金黄色葡萄球菌nucFtCCTCTTTGCGTATTGCCCTTGCTGGCATATGTATGGCAATCBtTTCCCGTTATGCGTTTCTCCTACGCCATTATCTGTTTGTGAIFCGAAACATTACTGATAGCCATCCCIBGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGC单核细胞增生李斯特氏菌hlyAFtTTTTACAGGGAGAACATCTATTTCGAGCCTAACCTATCCBtTCTACAAGAGGGACATTTTTACCGTTTGATTTAGTGGCATTIFGCTTTTACGAGAGCACCIBGCCAGGTATGACTAATCAAGAC金黄色葡萄球菌阳性菌株nuc靶标序列如下：ATGACAGAATACTTATTAAGTGCTGGCATATGTATGGCAATCGTTTCAATATTACTTATAGGGATGGCTATCAGTAATGTTTCGAAAGGGCAATACGCAAAGAGGTTTTTCTATTTCGCTACTAGTTGTTTAGTGTTAACTTTAGTTGTAGTTTCAAGTCTAAGTAGCTCAGCAAATGCATCACAAACAGATAATGGCGTAAATAGAAGTGGTTCTGAAGATCCAACAGTATATAGTGCAACTTCAACTAAAAAATTACATAAAGAACCTGCGACATTAATTAAAGCGATTGATGGTGATACGGTTAAATTAATGTACAAAGGTCAACCAATGACATTCAGACTATTATTGGTTGATACACCTGAAACAAAGCATCCTAAAAAAGGTGTAGAGAAATATGGTCCTGAAGCAAGTGCATTTACGAAAAAAATGGTAGAAAATGCAAAGAAAATTGAAGTCGAGTTTGACAAAGGTCAAAGAACTGATAAATATGGACGTGGCTTAGCGTATATTTATGCTGATGGAAAAATGGTAAACGAAGCTTTAGTTCGTCAAGGCTTGGCTAAAGTTGCTTATGTTTATAAACCTAACAATACACATGAACAACTTTTAAGAAAAAGTGAAGCACAAGCAAAAAAAGAGAAATTAAATATTTGGAGCGAAGACAACGCTGATTCAGGTCAATAA单核细胞增生李斯特氏菌阳性菌株hlyA靶标序列如下：ATGAAAAAAATAATGCTAGTTTTTATTACACTTATATTAGTTAGTCTACCAATTGCGCAACAAACTGAAGCAAAGGATGCATCTGCATTCAATAAAGAAAATTCAATTTCATCCATGGCACCACCAGCATCTCCGCCTGCAAGTCCTAAGACGCCAATCGAAAAGAAACACGCGGATGAAATCGATAAGTATATACAAGGATTGGATTACAATAAAAACAATGTATTAGTATACCACGGAGATGCAGTGACAAATGTGCCGCCAAGAAAAGGTTACAAAGATGGAAATGAATATATTGTTGTGGAGAAAAAGAAGAAATCCATCAATCAAAATAATGCAGACATTCAAGTTGTGAATGCAATTTCGAGCCTAACCTATCCAGGTGCTCTCGTAAAAGCGAATTCGGAATTAGTAGAAAATCAACCAGATGTTCTCCCTGTAAAACGTGATTCATTAACACTCAGCATTGATTTGCCAGGTATGACTAATCAAGACAATAAAATAGTTGTAAAAAATGCCACTAAATCAAACGTTAACAACGCAGTAAATACATTAGTGGAAAGATGGAATGAAAAATATGCTCAAGCTTATCCAAATGTAAGTGCAAAAATTGATTATGATGACGAAATGGCTTACAGTGAATCACAATTAATTGCGAAATTTGGTACAGCATTTAAAGCTGTAAATAATAGCTTGAATGTAAACTTCGGCGCAATCAGTGAAGGGAAAATGCAAGAAGAAGTCATTAGTTTTAAACAAATTTACTATAACGTGAATGTTAATGAACCTACAAGACCTTCCAGATTTTTCGGCAAAGCTGTTACTAAAGAGCAGTTGCAAGCGCTTGGAGTGAATGCAGAAAATCCTCCTGCATATATCTCAAGTGTGGCGTATGGCCGTCAAGTTTATTTGAAATTATCAACTAATTCCCATAGTACTAAAGTAAAAGCTGCTTTTGATGCTGCCGTAAGCGGAAAATCTGTCTCAGGTGATGTAGAACTAACAAATATCATCAAAAATTCTTCCTTCAAAGCCGTAATTTACGGAGGTTCCGCAAAAGATGAAGTTCAAATCATCGGCGGCAACCTCGGAGACTTACGCGATATTTTGAAAAAAGGCGCTACTTTTAATCGAGAAACACCAGGAGTTCCCATTGCTTATACAACAAACTTCCTAAAAGACAATGAATTAGCTGTTATTAAAAACAACTCAGAATATATTGAAACAACTTCAAAAGCTTATACAGATGGAAAAATTAACATCGATCACTCTGGAGGATACGTTGCTCAATTCAACATTTCTTGGGATGAAGTAAATTATGATCCTGAAGGTAACGAAATTGTTCAACATAAAAACTGGAGCGAAAACAATAAAAGCAAGCTAGCTCATTTCACATCGTCCATCTATTTGCCTGGTAACGCGAGAAATATTAATGTTTACGCTAAAGAATGCACTGGTTTAGCTTGGGAATGGTGGAGAACGGTAATTGATGA