文冠果组织培养育苗技术规程

1DB21/TXXXXX—2022文冠果组织培养育苗技术规程本文件规定了文冠果（XanthocerassorbifoliumBunge）组织培养育苗过程中外植体选择、消毒灭菌、初代培养、继代培养、生根培养、组培苗移栽及技术档案等。本文件适用于文冠果在辽宁省组织培养工厂化育苗。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6001育苗技术规程DB21/T2433-2015树莓组培育苗技术规程3术语与定义下列术语和定义适用于本文件。3.1文冠果XanthocerassorbifoliumBunge无患子科（SapindaceaeJuss.）文冠果属（XanthocerasBunge）的多年生落叶乔木。3.2组织培养tissueculture又叫离体培养，将植物体离体的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）、组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）或细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）以及原生质体，在无菌条件下，培养在人工培养基上，给予适宜的培养条件，诱导出愈伤组织，不定芽、不定根，最后形成完整的植株，即组织培养。3.3外植体explant植物组织培养中作为离体培养材料的器官（如根、茎、叶、茎尖、花、果实等）或组织（如形成层、表皮、皮层、髓部细胞、胚乳等）的片段，以及细胞（如大孢子、小孢子、体细胞等）或原生质体。在继代培养时，将培养的组织切段移入新的培养基时，这种切段也称外植体。3.42DB21/TXXXXX—2022初代培养primaryculture又称诱导芽培养，外植体接种到培养基上以后，一般先放在培养室进行弱光培养，首先要得到无菌的材料，然后逐渐促进材料的分化和生长，这是试管苗的第一代，称初代培养。3.5继代培养subculture又称分化培养，初代培养以后通过不断调试培养基和转接试管苗，使试管苗数量很快扩大，这种不断转接增殖的过程称为继代培养。3.6生根培养rootingculture大量继代增殖以后能形成无根的芽苗，在培养基上，利用从茎表皮细胞分裂形成突起的根原基，进一步从表皮培养形成根的过程。4外植体的选取4.1选取的部位选取文冠果茎尖、茎段。4.2取材季节在春季芽开始萌发或正萌发生长时取材。4.3器官发育年龄的选取以当年半木质化枝的嫩芽、嫩枝段做材料，分生能力强，形态建成快。4.4取材的大小茎尖、茎段长0.5cm～1.0cm，每段留芽1个～2个。5消毒灭菌及外植体准备5.1接种器具灭菌剪子、镊子、500mL烧杯（处理外植体使用）用牛皮纸包装，做到无漏洞，捆绑好，用高压灭菌锅在压力1.1MPa、温度121℃下，灭菌20min。5.2培养基高压灭菌用高压灭菌锅在压力1.1MPa、温度121℃下，灭菌20min。5.3外植体采集与处理早8:00前，用消毒过的剪刀，采集文冠果半木质化嫩枝作为外植体，用清洁水漂洗1h～2h，再用流水冲洗干净，标记好编号。将外植体叶片剪掉，留1cm～2cm的叶柄，用流水冲洗10min～30min，剪成3cm～5cm带芽茎段。3DB21/TXXXXX—20225.4外植体消毒灭菌将洗干净的外植体拿到超净台内，用75%酒精冲洗30s～60s，无菌水冲洗3次，再用次氯酸钠溶液消毒3min～10min，无菌水洗4次水洗,间隔不少于5min，冲洗次数以水清澈为准。5.5外植体准备将已灭菌的枝条去掉顶端和底部，切成0.5cm～1cm带芽茎段、茎尖。6初代培养6.1初代培养基配方初代培养基：S+6-苄基腺嘌呤1mg/L+吲哚-3-丁酸0.1mg/L+山梨酸钾20mg/L+糖30g/L+琼脂6g/L。6.2培养环境条件培养室温度23℃~25℃,湿度20%～30%，光照强度2200lx～2500lx，整齐摆放在培养架上，培养室技术要求参照DB21/T2433-2015。6.3培养方法在超净工作台上将准备好的外植体接种在初代培养基上。暗培养3d后转入光培养，培养25d～35d茎段上萌发出不定芽。7继代培养7.1继代培养基配方继代培养基：减少200mg/L硝酸铵的MS培养基+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+萘乙酸0.1mg/L+糖30g/L+琼脂6g/L。壮苗培养基：减少200mg/L硝酸铵的MS培养基+6-苄基腺嘌呤0.1mg/L+萘乙酸0.1mg/L+维生素B12mg/L+糖30g/L+琼脂6g/L。7.2培养环境条件参照6.2。7.3培养方法外植体长满培养瓶，就需转入到新的继代培养基中，在超净工作台上，用接种剪子和镊子剪成1.0cm～1.2cm茎段插入培养瓶内，每瓶10段～15段。继续培养25d～30d，待其长满瓶后转入壮苗培养基中继续培养，重复操作。这样一代一代地继续下去，就形成了文冠果组培苗的无性繁殖体系。文冠果扩繁方法为分株繁殖方式，扩繁继代过程的扩繁系数为6。8生根培养8.1生根培养基配方4DB21/TXXXXX—2022文冠果组织培养的生根培养基：1/2MS培养基+吲哚-3-丁酸1mg/L+维生素C150mg/L+糖30g/L+琼脂6g/L。8.2培养室环境条件培养室温度18℃~25℃,湿度20%～30%，光照强度2200lx～2500lx，整齐摆放在培养架上，培养室技术要求参照DB21/T2433-2015。8.3培养方法文冠果采用培养基瓶内一步生根法生根。在无菌超净工作台上，从壮苗培养后的芽丛中切割单株，用接种剪子和镊子剪成1.0cm～1.2cm茎段插入培养瓶内，每瓶插10株～15株。在黑暗环境中培养8d~10d,根原基开始萌动后，开始正常培养。8.4根的生长生根过程为25d～30d，根数1条～5条，颜色白色，吸收力强，移栽成活率高。9组培苗的移栽9.1移苗的季节文冠果组培苗移入温室全年均可进行，最佳时间为早春。9.2移苗的方法9.2.1清除培养基文冠果组培苗从瓶中取出，放在20℃左右的水中，将附着在根上的培养基进行彻底清洗，注意不能伤根；对长度超过5cm的根进行适当修剪。最后蘸根宝3号生根剂1000倍液～2000倍液促进生根。9.2.2穴盘准备采用5×10的穴盘。将基质添加入穴盘的每一个穴位。基质要求排水性和透气性良好，同时有一定的保水性；可采用草炭和沙子按照比例1:1进行混合，然后用敌克松500倍液～800倍液均匀喷洒进行消9.2.3组培苗移栽采用穴盘移栽文冠果组培苗。栽植标准为：苗木根系舒展，上不埋心，下不露根，并轻轻镇压，栽植后用细喷雾器喷水，冲掉叶面上沾着的基质，使根系与基质密切接触。9.2.4移栽后的管理移栽后30d之内移栽后30d之内的管理措施见附录A。移栽30d后文冠果组培苗在穴盘中生长30d后，根系与基质已经形成根团，即可移栽至可降解营养钵中。移栽时要求基质不散落，移栽后及时浇水。每7d～10d喷布一次杀菌剂多抗霉素1000倍液、异菌多菌灵15005DB21/TXXXXX—2022倍液（或恶霉灵1000倍液）、阿维菌素1500倍液～2000倍液，防治根腐病、灰霉病、红蜘蛛。具体防治药剂及配制方法见附录B。9.3组培苗成苗文冠果组培苗在营养钵中生长40d后，达到苗木等级Ⅰ、Ⅱ级，即成苗、可出圃。详见附录C。10技术档案按GB/T6001要求，建立相应育苗技术管理档案。6DB21/TXXXXX—2022（资料性）文冠果组培苗移栽30d之内管理措施表A文冠果组培苗移栽30d之内管理措施20℃~25℃。20℃~25℃。20℃~25℃。