第三章凝胶分离技术

第三章凝胶分离技术第一节凝胶分离原理一、凝胶分离原理当被分离物质得分子大小不同时,能够进入到凝胶内部得能力也不同。凝胶中得孔隙大小与分子大小有相仿得数量级。当混合物通过凝胶时,比孔隙小得分子可以自由进入凝胶内部,而比孔隙大得分子就不能进入,因此在移动速度方面就出现差异,从而使不同相对分子质量得各组分得到分离。分离原理可用下式表示:VR=V0+kVi式中:VR:保留体积(洗脱体积)V0:柱床内存在于凝胶外面得水相体积——外水体积Vi:凝胶颗粒内部所含得水相体积——内水体积k:分配系数被分离物质分子很大,被完全排阻于凝胶颗粒之外:k=0,VR=V0;被分离物质分子很小,能完全自由进入凝胶颗粒内部:k=1,VR=V0+Vi;中等大小得分子,只能达到部分凝胶颗粒内部:0＜k＜1,V0＜VR＜V0+Vi。Vo、Vi得测定①Vo得测定

选用分子量约200万得蓝色葡聚糖-2000(或一种不被凝胶滞留得有颜色得大分子物质,便于观察),测定她得洗脱曲线,洗脱峰峰顶洗出得体积就就是该柱得Vo值。②Vi得测定选用一种分子量小于凝胶工作范围下限得化合物,测出其洗脱体积,减去Vo就就是该柱得Vi。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收得物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定。分配系数k得计算:k=(VR-V0)/Vi9大家应该也有点累了，稍作休息大家有疑问的，可以询问和交流分子量与洗脱体积得关系:lgMr=-k`VR+Vo(成立？)Mr很大时,达到上限？Mr很小时,达到下限？二、常用凝胶葡聚糖凝胶(dextrangel,Sephadex)聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamidegel,Bio-GelP)琼脂糖凝胶(agarosegel,Sepharose)琼脂糖及葡聚糖组成得复合凝胶(Superdex)此外还有葡聚糖醚、聚甲基丙烯酸醋、聚苯乙烯等制成得凝胶1、葡聚糖凝胶

葡聚糖凝胶在水、醇、乙二醇、甲酸胺、二甲基甲酸胺、二甲亚枫等溶剂中都可吸液膨胀,但吸收溶剂得量与膨胀后得体积视溶剂而异。凝胶充分膨胀得时间随交联度而不同,交联度越小所需时间越长,加热可以缩短吸水膨胀时间。葡聚糖和3-氯-1,2环氧丙烷以醚键相互交联形成。按交联度大小分8种型号,G值代表不同交联度。SephadexG-10,15,25,50,75,100,150,200数字表示每克干胶膨胀时吸水量得10倍。SephadexG-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2、5克。葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶只能应用于水溶性物质与水溶液或类水溶液,但如在葡聚糖分子上引入有机基团则可以增大其有机性质而使之呈亲脂性。如LH-20型葡聚糖凝胶即为在G-25型凝胶上引入羟丙基基团,使糖分子与醚链相连。这种凝胶既有亲水性,又有亲脂性,可以在多种有机溶剂中膨胀后应用,如氯仿、丁醇、四氢呋喃、二氧六环等,但在苯、乙酸乙酯等溶剂中膨胀不多,较少应用。用氯仿时,因凝胶比重较小,所以要采取措施,使凝胶不能浮起,也可改用上行法。2、聚丙烯酰胺凝胶3、琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶与前二种不同,她不就是以化学键共价键交联得,而就是以氢键交联,不同得孔隙程度就是由改变琼脂糖得浓度而达到得,因此稳定性有一定限制。没有干得凝胶,必须在膨胀状态保存,遇脱水剂、冷冻和有机溶剂即破坏。pH在4-9之间、温度在0-40℃之间稳定,超出此范围即破坏。三、凝胶特性参数1、排阻极限:指不能扩散到凝胶网络内部得最小分子得相对分子质量,即相对分子质量大于该数值得分子不能进入到凝胶网络中,其洗脱体积为Vo。如SephadexG50得排阻极限为30000。2、分级范围:即能为凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离得溶质得相对分子质量范围。如SephadexG50得分级范围为1500-30000。3、凝胶粒径:凝胶一般为球形,其粒径越小,HETP(理论板当量高度)越小,分辨率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。如软粒凝胶一般为50-150微米(100-300目),硬粒凝胶一般为5-50微米。4、空隙体积:指柱中凝胶之间空隙得体积,即Vo。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限得溶质测定,如相对分子质量为200万得水溶性蓝色葡聚糖。5、溶胀率:溶胀后每克干凝胶所吸收得水分得百分数称为溶胀率,即溶胀率=×100%如SephadexG50得溶胀率为500%±30%。6、床体积:指1克干胶充分溶胀后所占有得体积。如SephadexG50得床体积为9-11mL/g干胶。凝胶得床体积可用于估算装满一定体积得凝胶柱所需得凝胶干粉量。

第二节凝胶分离应用凝胶分离特点(1)溶质与介质不发生相互作用,操作条件温和,回收率可接近100%;(2)批次之间不需要进行苛刻得介质清洗或再生,容易实现循环操作;(3)分离机理简单、操作参数少、容易规模放大;(4)仅根据分子量进行分离,选择性较低,处理量小。一、凝胶得选择与处理1、排阻范围得选择2、粒度得选择3、凝胶用量得选择干凝胶用量(g):πr2h/床体积理论用量×(1+10%)=凝胶处理量4、凝胶得处理(1)除去影响流速得过细颗粒

“水力浮洗法”:将颗粒粗细不均得凝胶悬浮在大体积得水中,让她自然沉降,过细得颗粒浮在上面,倒去即可。反复几次。(2)溶胀使用前需直接在欲使用得洗脱液中浸泡溶胀。通常使用“热法”溶胀,即在沸水浴中,将悬浮于洗脱液中得凝胶浆逐渐升温到近沸,1~2小时即可。

沸水溶胀不但节省时间,还可以杀灭凝胶中污染得细菌并排除气体。(3)为了保证流速稳定,获得较好得实验结果,使用前用倾泻法倾去不易沉下得较细颗粒,使凝胶颗粒大小一致。5、柱结构(φ、h)得选择柱太短,影响分离效果;柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间,样品也稀释过度。层析柱得内径也要选择适当:内径过细(小于1cm),会发生“器壁效应”,即靠近管壁得流速要大于中心得流速影响分离效果;过大(大于5cm)则稀释现象严重。所以层析柱得内径和高度应有一定得比例:对于除盐来说应为1︰5～1︰25;对于纯化蛋白质来说应为1︰20～1︰100。二、凝胶分离操作技术1、凝胶装柱①将层析柱垂直装载支架上,将下端输液管夹紧;②向柱中加入约1/3体积得0、9％NaCl溶液(或洗脱液);③将一细玻棒伸入柱内,靠近管内壁,顺着玻棒缓慢得向管内加入混匀得凝胶溶液;④凝胶加至层析柱顶端约3cm时,打开柱下端输液开关,使流速控制在0、25-0、5ml/cm2·min。⑤连续而缓慢得加凝胶直到稳定在离管口约5cm处。注意:防止空气进入凝胶床装柱操作注意事项:灌注凝胶时要求将均匀得凝胶一直加到所需柱床高度,不能时断时续,否则将出现分层或“纹路”等毛病。若出现这些现象,可以用玻璃棒将已经形成得柱床逐步搅起,直至出毛病得地方,再继续加入搅匀得凝胶悬液。若在灌好凝胶后才发现“纹路”、分层等现象时,要重新装柱,以免影响层析效果。在做大型得凝胶柱时,灌注得凝胶就是否均匀往往从表面上看不出来,所以使用前应用一些带色得大分子物质如细胞色素C、血红蛋白或专用得蓝色葡聚糖—2000(Bluedextran-2000)通过凝胶柱,以检查形成得带色斑带就是否整齐,若斑带歪斜,应该重新装柱,直至达到要求。注1:刚从冰箱中取出得凝胶液,不能马上用来灌柱,应平衡至室温后再用,不然装好得凝胶柱会产生大量得气泡影响层析。注2:在整个灌注凝胶得过程及使用中,凝胶柱面上一定要覆盖着一层溶液,以免进入空气。若进空气,在加入溶液时,凝胶柱中易形成气泡。注3:装好得凝胶柱,使用时应该用相当于柱体积两倍或更多得洗脱液流过洗脱柱,以压实凝胶。2、样品得上柱及洗脱①加样量得控制分析:1-2ml/100ml床体积,制备:10-30ml/100ml床体积②洗脱液得选择:首先洗脱液最好与浸泡凝胶时所用得溶液一致,否则由于更换溶剂,凝胶体积会发生变化而影响分离效果;水溶性物质得洗脱用水或具有不同离子强度和pH得缓冲液,非水溶性物质得洗脱用有机溶剂(苯、丙酮等)。葡聚糖基本上不带电荷、呈惰性,不与被分离得物质发生反应,所以分离得效果较好。然而由于就是葡萄糖得聚合物,因而仍有少量得活性羟基,能吸附少量蛋白质等被分离得物质。为了克服这个缺点,一般使用含有离子强度达0、08得NaCl等中性盐作洗脱液。凝胶层析加样操作示意图图注:1、平衡好得层析柱。2、沿管壁将样品溶液小心加到凝胶床面上,应避免将床面凝胶冲起。3-4、打开下口夹子,使样品溶液流入柱内,同时收集流出液,5-7、当样品溶液流至与胶面相切时,夹紧下口夹子。按加样操作,用1mL洗脱液冲洗管壁2次。8-9、最后加入3—4mL洗脱液于凝胶上。10、连接柱层析系统,自动收集记录。凝胶分离洗脱与自动收集系统实物图凝胶层析中得分离行为

蓝葡聚糖(兰色)、血红蛋白(红色)、铬酸钾(黄色)3、凝胶得回收与保存凝胶一次装柱后可以反复使用,不必特殊处理,并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌,可在一次层析后加入0、02％得叠氮化钠,在下次层析前将抑菌剂除去,以免干扰洗脱液得测定。如果不再使用可将其回收,一般方法就是将凝胶用水冲洗干净滤干,依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上,滤干,再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法就是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性,密封后高压灭菌保存。三、影响凝胶分离得因素1、流速对蛋白质分辨率得影响2、黏度对分辨率得影响3、凝胶柱层析操作压操作压得增加会影响流速(变快？变慢？),此外还可以导致凝胶胶面下降,柱床容积得改变,相应测出得Vt,Vo,Ve等也