蛋白质的分离纯化镜岩生物化学全

蛋白质的分离纯化镜岩生物化学全第一节蛋白质得酸碱性质

蛋白质得等电点蛋白质分子由氨基酸组成,在蛋白质分子中保留着游离得末端α—氨基与α—羧基以及侧链上得各种功能团。蛋白质也就是一类两性电解质,能与酸或碱发生作用。可解离基团主要来自侧链上得功能团

、对某一种蛋白质来说,在某一pH,它所带得正电荷与负电荷恰好相等,也即净电荷为零,这一pH称为蛋白质得等电点(与蛋白质所含氨基酸种类有关)。蛋白质得等离子点就是特征常数

蛋白质得电泳在等电点时(IsoelectricpointpI),蛋白质得溶解度最小,在电场中不移动。在不同得pH环境下,蛋白质得电学性质不同。在大于等电点得溶液中,蛋白质粒子带负电荷,在电场中向正极移动;在小于等电点得溶液中,蛋白质粒子带正电荷,在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。电泳利用蛋白质得电泳现象,可以将蛋白质进行分离纯化。第二节

蛋白质分子大小得测定常用测定方法:1、根据化学组成测定最低相对分子质量2、凝胶过滤法测定相对分子质量3、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量4、渗透压法5、沉降分析法(离心)一、根据化学组成测定最低相对分子质量

用化学分析方法测定出蛋白质中某一微量元素得含量,并假设蛋白质分子中只有一个铁原子。则可以由此计算出蛋白质得最低相对分子质量。例如,肌红蛋白含铁量为0、335％,其最低相对分子质量可按下式算出:最低相对分子质量=(铁得原子量/铁得百分含量)X100=(55、8/0、335)X100=16700二、凝胶过滤法测定相对分子质量凝胶过滤原理分子筛色谱(凝胶过滤)大家有疑问的，可以询问和交流可以互相讨论下，但要小声点利用Andrews得实验经验式:

logMr=a/b—Ve/bVoVe(elutionvolume)为某一溶质组分得洗脱体积。它就是自加样品开始到该组分得洗脱峰(峰顶)出现时所流出得体积。V0(outervolume)为外水体积,即存在于柱床中凝胶珠外孔隙得水相体积。测定出不能被凝胶滞留得大分子溶质如蓝色葡聚糖—2000得洗脱体积可以决定V0。

logMr三、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定相对分子质量

聚丙烯酰胺凝胶电泳,(简称PAGE),也称圆盘电泳,它以聚丙烯酰胺凝胶(单体丙烯酰胺Arc与交联剂甲叉双丙烯酰胺Bis共聚而成)为支持物。蛋白质颗粒在各种介质中电泳时,它得迁移率决定于它所带得电荷以及分子大小与形状(电荷效应、分子筛效应)。

如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠(SDS)与少量巯基乙醇,单体蛋白质或亚基得多肽链处于伸展状态,此时SDS以其烃链与蛋白质分子得侧链结合成复合体。结果:1、所有得SDS-蛋白质复合体都具有相同得荷质比。2、具有相同得构象。因此蛋白质分子得电泳迁移率主要取决于它得相对分子质量,而与原来所带得电荷与分子形状无关。十二烷基磺酸钠原态蛋白质变性？磺酸基极性亲水烷基亲油（蛋白质疏水区）

在聚丙烯酰胺凝胶中由于引入凝胶得分子筛效应,电泳迁移率与多肽链分子量得对数有下列关系:

logMr=a—bμR式中Mr为相对分子质量,a、b都就是常数,μR就是相对迁移率:

μR=样品迁移距离/前沿(染料)迁移距离

实验测定时,以几种相对分子质量标准物蛋白质得Mr得对数值对其μR值作图,根据待测样品得μR,从标准曲线上查出它得Mr。最准确可靠得方法就是超离心法(Svedberg于1940年设计):蛋白质颗粒在25~50*104g离心力作用下从溶液中沉降下来。沉降系数(s):单位(cm)离心场里得沉降速度。

s=————vω2x

v=沉降速度(dx/dt)ω=离心机转子角速度(弧度/s)

x=蛋白质界面中点与转子中心得距离(cm)沉降系数得单位常用S,1S=1×10-13(s)蛋白质分子量(M)与沉降系数(s)得关系M=——————RTsD（1－Vρ）R—气体常数（8.314×107ergs·mol-1·度-1）T—绝对温度D—扩散常数（蛋白质分子量很大，离心机转速很快，则忽略不计）V—蛋白质的微分比容（m3·g-1）ρ—溶剂密度（20℃，g·ml-1）

s—沉降系数第三节蛋白质得胶体性质与蛋白质得沉淀一、蛋白质得胶体性质

蛋白质溶液就是一种分散系统。蛋白质分子颗粒就是分散相,水就是分散介质。就其分散程度而言蛋白质溶液属于胶体系统。分散相质点在胶体系统中保持稳定应具备三个条件:A、分散相得质点大小在1-100nm范围内。动力学上稳定,能作不断得布朗运动。真溶液(1nm)<胶体溶液<悬浮液(100nm)B、分散相得质点带有同种电荷,互相排斥,不易聚集成大颗粒而沉淀。C、分散相得质点能与溶剂形成溶剂化层(如水化层)蛋白质溶液性质:1、蛋白质分子颗粒在1-100nm范围内。2、形成水化层:分子表面上亲水基团在水溶液中能与水分子起水化作用3、构成稳定得双电层:分子表面上得可解离基团,在适当得pH条件下,都带有相同得净电荷,与其周围得反离子构成稳定得双电层。++++++++++++------------+4、蛋白质溶液也与一般得胶体系统一样具有丁达尔效应、布朗运动以及不能通过半透膜等性质由于胶体溶液中得蛋白质不能通过半透膜,因此可以应用透析法将非蛋白得小分子杂质除去。二、蛋白质得沉淀

蛋白质在溶液中得稳定性与它得分子量大小、所带得电荷与水化作用有关,就是有条件得、相对得。如果条件发生改变,破坏了蛋白质溶液得稳定性,蛋白质就会从溶液中沉淀出来。在温与条件下,通过改变溶液得pH或电荷状况,使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中,结构与性质都没有发生变化,在适当得条件下,可以重新溶解形成溶液,所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀就是分离与纯化蛋白质得基本方法,如等电点沉淀法、盐析法与有机溶剂沉淀法等。可逆沉淀在强烈沉淀条件下,不仅破坏了蛋白质胶体溶液得稳定性,而且也破坏了蛋白质得结构与性质,产生得蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质得结构与性质得变化,所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀与生物碱试剂沉淀等都属于不可逆沉淀。不可逆沉淀沉淀蛋白质得方法有以下几种:(1)盐析法:向蛋白质溶液中加人大量得中性盐(硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等),使蛋白质脱去水化层而聚集沉淀。盐析沉淀一般不引起蛋白质变性。当除去盐后,又可溶解。

(2)有机溶剂沉淀法

极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等),因引起蛋白质脱去水化层以及降低介电常数而增加带电质点间得相互作用,致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。(3)重金属盐沉淀法(4)生物碱试剂与某些酸类沉淀法(5)加热变性沉淀法

几乎所有得蛋白质都因加热变性而凝固。原因可能就是由于热变性就是蛋白质天然结构解体,疏水基外露,因而破坏了水化层,同时由于蛋白质处于等电点也破坏了带电状态(当处于等电点时)。

少量盐类促进蛋白质得加热凝固。(豆腐)我国很早就创造了将大豆蛋白质得浓溶液加热并点入少量盐卤(含MgCl2)得制豆腐得方法,这就是成功得应用加热变性沉淀蛋白质得一个例子。

点卤时,由于盐卤就是电解质,它们在水里会分成许多带电得小颗粒——正离子与负离子,由于这些离子得水化作用而夺取了蛋白质得水膜,以致没有足够得水来溶解蛋白质。另外,盐得正负离子抑制了由于蛋白质表面所带电荷而引起得斥力,这样使蛋白质得溶解度降低,而颗粒相互凝聚成沉淀。这时,豆浆里就出现了许多白花花得东西了。

盐卤里有许多电解质,主要就是钙、镁等金属离子,它们会使人体内得蛋白质凝固,所以人如果多喝了盐卤,就会有生命危险。

第四节蛋白质分离纯化得一般原则

分离纯化某一特定蛋白质得一般程序可以分为:

1、前处理

2、粗分级分离

3、细分级分离

1、前处理(pretreatment)

分离纯化某一蛋白质,首先要求把蛋白质从原来得组织或细胞中以溶解得状态释放出来,并保持原来得天然状态,不丢失生物活性。动物材料应先剔除结缔组织与脂肪组织,种子材料应先去壳甚至去种皮以免受杂质得污染,油料种子最好先用低沸点得有机溶剂如乙醚等脱脂。然后根据不同得情况,选择适当得方法,将组织与细胞破碎。动物组织与细胞可用电动捣碎机或匀浆器破碎或用超声波处理破碎。植物组织与细胞,由于具有由纤维素、半纤维素与果胶等物质组成得细胞壁,一般需要用与石英砂或玻璃粉与适当得提取液一起研磨得方法破碎,液氮破碎或用纤维素酶处理也能达到目得。细菌细胞得破碎得常用方法有超声波震荡,与砂研磨、高压挤压或溶菌酶处理(以分解肽聚糖)等。组织与细胞破碎以后,选择适当得缓冲液把所要得蛋白质提取出来。细胞碎片等不溶物用离心或过滤等方法除去。

如果所要得蛋白质主要集中在某一细胞组分,如细胞核、染色体、核糖体或可溶性得细胞质等,则可利用差速离心方法将它们分开如果碰上所要蛋白质就是与细胞膜或膜质细胞器结合得,则必须利用超声波或去污剂使膜结构解聚,然后用适当得介质提取。2、粗分级分离(roughfractionation)

当蛋白质提取液(有时还杂有核酸、多糖之类)获得后,选用一套适当得方法,将所要得蛋白质与其她杂蛋白分离开来。一般这一步得分级分离用盐析、等电点沉淀与有机溶剂分级分离等方法。这些方法得特点就是简便、处理量大,既能除去大量杂质(包括脱盐),又能浓缩蛋白质溶液。有些蛋白质提取液体积较大,又不适于用沉淀或盐析法浓缩,则可采用超过滤、冷冻真空干燥或其她方法(如聚乙二醇浓缩法)进行浓缩。3、细分级分离(finefractionation)

进一步纯化,一般使用层析法包括凝胶过滤,离子交换层析,吸附层析以及亲与层析等。必要时还可选择电泳法,包括区带电泳、等电聚焦等作为最后得纯化步骤。用于细分级分离得方法一般规模较小,但分辨率很高。

4、结晶

结晶过程本身也伴随着一定程度得纯化,蛋白质纯度愈高,溶液愈浓就愈容易结晶。尽管结晶并不能保证蛋白质一定就是均一得,但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。由于结晶中从未发现过变性蛋白质,因此蛋白质得结晶不仅就是纯度得一个标志,也就是断定制品处于天然状态得有力指标。结晶也就是进行X射线晶体学分析所要求得,结晶得最佳条件就是使溶液略处于过饱与状态,此时较易得到结晶。接入晶种常能加速结晶过程。

第五节蛋白质得分离纯化方法

几种常用得蛋白质纯化方法:根据蛋白质在溶液中得性质分离纯化蛋白质得方法:①分子大小;②溶解度;③电荷;④吸附性质;⑤对配体分子得生物学亲与力等。

一、根据分子大小不同得纯化方法

1、透析与超过滤透析(dialysis)就是利用蛋白质分子不能通过半透膜得性质,使蛋白质与其她小分子物质如无机盐、单糖等分开。常用得半透膜就是玻璃纸与其她改型得纤维素材料。

超滤就是利用压力或离心力,强行使水与其她小分子溶质通过半透膜,而蛋白质被截留在膜上,以达到浓缩与脱盐得目得。2、密度梯度(区带)离心

蛋白质颗粒在具有密度梯度得介质中离心时,质量与密度大得颗粒比质量与密度小得颗粒沉降得快,并且每种蛋白质颗粒沉降到与自身密度相等得介质密度梯度时,即停止不前,最后各种蛋白质在离心管中被分离成独立得区带,

密度梯度常用得密度梯度有蔗糖梯度,聚蔗糖梯度。蔗糖便宜,纯度高,浓溶液(60％,W／W)密度可达1、28g／cm3。聚蔗糖得商品名就是Ficoll,它就是由蔗糖与1—氯—2,3—环氧丙烷合成得高聚物,Mr约400000。密度梯度在离心管内得分布就是管底得密度最大,向上逐渐减小

3、凝胶过滤层析(分子排阻

)(1)凝胶过滤得介质

凝胶过滤所用得介质就是凝胶颗粒,其内部就是多孔得网状结构,

经常使用得凝胶种类:(1)葡聚糖凝胶,就是由线形得α—1,6葡聚糖与1—氯—2,3葡聚糖—环氧丙烷反应而成得化合物,它得商品名称为Sephadex。不同型号得Sephadex用G来表示。G后面得数字-10、200表示吸水量为1、20克/克干胶。如SephadexG-100交联葡聚糖凝胶得种类有G-10,G-15,G-25,G-50,G-75,G-100,G-150,与G-200。因此,“G”反映凝胶得交联程度,膨胀程度及分部范围。交联度越高,凝胶孔径越小。G10、15、25分离范围<5000适用于脱盐、肽与其它小分子得分离,胶柱长要求15-25厘米。G-50分离范围1500-30000G-75分离范围3000-80000G-100分离范围4000-150000G-200分离范围5000-600000适用于各类生物分子得分离,胶柱长要求80厘米以上。(2)聚丙烯酰胺凝胶

(商品名称为Bio-gelP)就是一种人工合成得凝胶,它就是由单体丙烯酰胺(Acr)与交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)共聚而成得。不同型号得Bio-gel用P来表示。P后面得数字再乘以1000为该型号得排阻极限,表示当某一物质得分子量大于或等于某一值时,完全不进入凝胶。如Bio-gelP-60(3)琼脂糖凝胶商品名称为Sepharose或Bio-GelA,琼脂糖就是从琼脂中分离制得得,这种凝胶得优点就是孔径大,排阻极限高。不同型号得Sepharose用B来表示。B前面得数字表示凝胶中含干胶得量,如Sepharose6B二、利用溶解度差别得纯化方法

影响蛋白质溶解度有:自身因素:在同一得外部条件下,不同蛋白质具有不同得溶解度,这就是因为溶解度归根结底取决于它们本身得分子结构,例如分子所带电荷得性质与数量、亲水基团与疏水基团得比例,它们在蛋白质分子表面得排列以及由此而产生得偶极矩等。外部因素:很多,其中主要有:①溶液得pH,②离子强度,③介电常数,④温度。1、pH控制蛋白质得沉淀蛋白质处于等电点时,其静电荷为零,由于相邻蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于聚集沉淀。不同得蛋白质具有不同得等电点,利用蛋白质在等电点时溶解度最低得原理,可以把蛋白质混合物分开。

2、蛋白质得盐溶与盐析

盐溶:低浓度时,中性盐可以增加蛋白质得溶解度,这种现象称为盐溶。由于蛋白质分子吸附某种盐类离子后,带电层使蛋白质分子彼此排斥,而蛋白质分子与水分子间得相互作用却加强,因而溶解度增高盐溶

盐析:当溶液得离子强度增加到一定数值时,蛋白质溶解度开始下降。当离子强度增加到足够高时,例如饱与或半饱与得程度,很多蛋白质可以从水溶液中沉淀出来,这种现象称为盐析(saltingout)。大量中性盐得加入使水得活度降低,原来溶液中得大部分甚至全部得自由水转变为盐离子得水化水。导致蛋白质表面得疏水基团得暴露盐析((NH4)2SO4、Na2SO4

)3、有机溶剂分级分离法

与水互溶得有机溶剂(如甲醇、乙醇与丙酮等)能使蛋白质在水中得溶解度显著降低。在室温下,这些有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀,而且伴随着变性。有机溶剂分级分离得机理有机溶剂引起蛋白质沉淀得主要原因之一就是改变了介质得介电常数。水就是高介电常数物质(20℃时,80),有机溶剂就是低介电常数物质(20℃时,甲醇33,乙醇24,丙酮21、4),因此有机溶剂得加入使水溶液得介电常数降低。这样,蛋白质分子表面可解离基团得离子化程度减弱,水化程度降低,因此促进了蛋白质分子得聚集与沉淀。有机溶剂引起蛋白质沉淀得另一重要方式可能与盐析相似,与蛋白质直接争夺水化水,致使蛋白质聚集而沉淀。4、温度对蛋白质溶解度得影响

在一定温度范围内,约0～40℃之间,大部分球状蛋白质得溶解度随温度升高而增加,

在40～50℃以上,大部分蛋白质变得不稳定并开始变性,一般在中性pH介质中即失去溶解能力。大多数蛋白质在低温下比较稳定,因此蛋白质得分级分离操作一般都在0℃或更低得温度下进行。

三、根据电荷不同得纯化方法

根据蛋白质得电荷不同即酸碱性质不同分离蛋白质混合物得方法有电泳与离子交换层析两类

一、电泳(electrophoresis)在外电场得作用下,带电颗粒,向着与其电性相反得电极移动,这种现象称为电泳。

蛋白质电泳分离原理:分子大小不同得蛋白质所带电种类不同,净电荷密度不同,迁移率不同,因此,在电泳时可以分开。1、电泳得类型

目前电泳得类型很多,最常见得就是区带电泳,由于在支持物上电泳时蛋白质混合物被分离成若干区带而得名。区带电泳按其支持物得物理性状不同可以分成4类:①滤纸电泳与薄膜电泳(如醋酸纤维薄膜电泳与聚酰胺薄膜电泳);②粉末电泳,支持介质就是淀粉、纤维素粉或硅胶粉等,粉末与适当得溶剂调与,铺设成平板;③细丝电泳,如尼龙丝与其她人造丝电泳,这就是一类微量电泳;④凝胶电泳,最常用得支持介质有聚丙烯酰胺与琼脂糖凝胶,前者适于分离蛋白质与多核苷酸,后者适于分离核酸,这两种凝胶电泳得分辨率都很高,

-++—2、聚丙烯酰胺凝胶电泳

(polyacrylamindegelelectrophoresis,简称PAGE)也称圆盘电泳,它就是在区带电泳得基础上发展起来得。它以聚丙烯酰胺凝胶为支持物,一般制作成凝胶柱或凝胶板,垂直板电泳得优越性:①表面积大而薄,便于通冷却水以降低热效应,条带更清晰;②在同一块胶板上,可同时进行10个以上样品得电泳,便于在同一条件下比较分析鉴定,还可用于印迹转移电泳及放射自显影;③胶板制作方便,易剥离,样品用量少,分辨率高,不仅可用于分析,可用于制备;④胶板薄而透明,电泳染色后可制成干板,便于长期保存与扫描;⑤可进行双向电泳。按其凝胶得组成系统可分成四种:(1)连续凝胶电泳:只用一层凝胶,采用相同得pH值与相同得缓冲液。(2)不连续凝胶电泳:采用二层或三层性质不同得凝胶(即:样品胶、浓缩胶与分离胶)重叠起来,使用两种不同得pH值(6、7与8、3)与不同得缓冲液(Tris-HCl与Tris-Gly)(3)孔梯度凝胶电泳:采用梯度混合装置,使制得得凝胶由上至下孔径逐渐减小(即凝胶浓度由上至下逐渐增高)。梯度凝胶电泳主要适宜于测定球蛋白得相对分子质量。(4)SDS—凝胶电泳:在聚丙烯酰胺凝胶中加入SDS(十二烷基硫酸钠)

(5)等电聚焦凝胶电泳:(IEF)

在电泳支持介质中加入载体两性电解质(carrierampholytes),通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续与线性得pH梯度,蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动,它得分离仅仅决定于其本身得等电点。3、凝胶聚合得原理及有关特性

1、聚合反应

凝胶得聚合单体:丙烯酰胺(Acr)与交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis);常用过硫酸铵(AP)为催化剂,四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。TEMED得碱基可催化AP水溶液产生游离氧原子,激活Acr单体,使其聚合成单体长链,在Bis作用下,聚合成网状凝胶(化学聚合)。碱性条件下凝胶易聚合,室温下7、5％得凝胶在pH8、8时30min聚合,在pH4、3时约需90min。此外,核黄素亦可为催化剂,聚合需光照(光聚合),故使用不多。

凝胶得孔径随着Acr得浓度得变化而变化,也跟Bis得浓度有关T％=(a+b)/m×l00％c％=b/(a+b)×100％式中a:Acr克数;b:Bis克数;

m:缓冲液体积(ml)。

T:Acr与Bis总浓度

c:交联剂百分比再按要求配制不同浓度得凝胶。注意点:1、Acr-Bis贮液在自然光、Υ射线、超声波得引发下会发生聚合,故应放在棕色瓶中避光保存。30%得贮液4℃下只能保存一个月。2、Acr、Bis均为神经毒性,勿触及皮肤与粘膜。3、过硫酸铵应现配现用。定溶至100毫升得T=30%C=2.6%的贮液Acr29.2克Bis0.8克凝胶浓度与被分离物相对分子质量得关系T％

凝胶得孔径与样品得迁移率有关ABT%迁移率分子量：A〈B

电荷：A〈B迁移率随着凝胶浓度得变化而变化单一条带不能说明就是一种组分

连续系统:

电泳体系中缓冲液、pH值及凝胶浓度相同,即只有分离胶。带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷效应与分子筛效应,无浓缩效应。

4、连续凝胶系统与不连续凝胶系统

不连续系统:一般常用二层或三层。由上而下分为:1、样品胶

2、浓缩胶

3、分离胶电泳体系中各层胶中缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度都不同。

样品胶:T=3％,c=2、6％,缓冲液为pH6、8得Tris-HCl,其作用就是防止对流,促使样品浓缩以免被电极缓冲溶稀释。目前,一般不用样品胶,直接将样品加入蔗糖或甘油后加在浓缩胶得表面,同样具有防止对流及样品被稀释得作用。

浓缩胶:

T=5％,c=2、6％得大孔胶,缓冲液为pH6、8得Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷),其作用就是使样品进入分离胶前,被浓缩成窄得区带,从而提高分离效果。浓缩效应

分离胶:T=7、0％一20%,c=2、5％得小孔胶,缓冲液为pH8、9得Tris-HCl,大部分蛋白质在此pH条件下带负电荷,样品在该层被分离。电荷效应与分子筛效应,不连续PAGE电泳得3种物理效应:①样品得浓缩效应;②凝胶对被分离分子得筛选效应(颗粒小得移动快,颗粒大得移动慢);③一般电泳分离得电荷效应。由于这3种物理效应,使样品分离效果好,分辨率高。人血清用纸电泳只能分成5～7个组分,而圆盘电泳则可分成几十个清晰得条带。

①样品浓缩效应(由三种不连续性造成)

(1)凝胶孔径得不连续性

上述三层凝胶中,样品胶及浓缩胶为大孔胶;分离胶为小孔胶。在电场作用下,样品颗粒在大孔胶中泳动得阻力小,移动速度快;当进入小孔胶时,受到得阻力大,移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处,样品迁移受阻而压缩成很窄得区带。浓缩胶分离胶(2)缓冲体系离子成分及pH值得不连续性

HCl在任何pH溶液中均易解离出Cl—,在电场中迁移率快,走在最前面称为快离子。在电极缓冲液中,除有Tris外,还有甘氨酸,其pI=6、0,在pH8、9得电极缓冲液中,易解离出甘氨酸根(NH2CH2COO—),而在pH6、7得凝胶缓冲体系中,甘氨酸解离度仅有0、1％～1％,因而在电场中迁移很慢,称为慢离子。Tris-HClpH=6、7pH=8、9GlyCl-Gly-Tris-HCl带负电得蛋白质,迁移率介于快离子与慢离子之间—+电泳缓冲体系,Tris-Gly,pH=8、3(3)电位梯度得不连续性

电泳开始后,快离子得快速移动会在其后形成一个离子强度很低得低电导区,使局部电位梯度增高,将蛋白质浓缩成狭窄得区带。②分子筛效应

大小与形状不同得蛋白质通过一定孔径分离胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率,这就就是分子筛效应。蛋白质进入pH8、9得同一孔径得分离胶后,分子小且为球状得蛋白质分子所受阻力小,移动快,走在前面;反之,则阻力大,移动慢,走在后面,从而通过凝胶得分子筛作用将各种蛋白质分成各自得区带。。

这种分子筛效应不同于柱层析中得分子筛效应,后者就是大分子先从凝胶颗粒间得缝隙流出,小分子后流出。③电荷效应

在pH8、9得分离胶中,各种带净电荷不同得蛋白质有不同得迁移率。净电荷多,则迁移快;反之,则迁移慢。因此,各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状,以一定顺序排成一个个区带。4、SDS—凝胶电泳:5、等电聚焦

(isoelectricfocusing,IEF)

等电聚焦就是60年代建立得一种高分辨率得蛋白质分离与分析技术。它就是利用蛋白质分子或其她两性电解质分子具有不同得等电点,从而在一个稳定、连续、线性得pH梯度中得到分离。

近年来,等电聚焦电泳技术得分辨率有了很大提高,可以分辨pI只差0、01得生物大分子,这就是等电聚焦最突出得优点,蛋白质等电聚焦电泳得基本原理

在电泳支持介质中加入载体两性电解质(carrierampholytes),通以直流电后在正负极之间形成稳定、连续与线性得pH梯度,蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用下泳动,它得分离仅仅决定于其本身得等电点。

当蛋白质分子一旦到达它得等电点位置,分子所带净电荷为0,就不能再迁移。如果它向等电点两侧扩散,净电荷就不再为0,都会被阴极或阳极吸引回来,直至回到净电荷为0得位置,因此蛋白质在与其本身pI相等得pH位置被聚焦成窄而稳定得区带。这种效应称之为“聚焦效应”。保证了蛋白质分离得高分辨率,就是等电聚焦最为突出得优点。1、分辨率高,可以分辨pI只差0、01—0、02得生物大分子。2、随着电泳时间得延长,区带越来越窄。其她电泳区带会越来越宽。3、样品可以加在胶板得任何部位。4、很稀得样品都可以分离,且重现性好。5、可以用来测定蛋白质或多肽得等电点。蛋白质等电聚焦电泳得特点

pH梯度得产生方式

产生pH梯度得方式有两种:(1)一种就是人工pH梯度,但由于缓冲液离子得电迁移与扩散使pH梯度不稳定

(2)另一种就是自然pH梯度,即在凝胶中加入载体两性电解质,在电场作用下形成连续得pH梯度,凝胶得防对流扩散作用使pH梯度保持稳定。

载体两性电解质得合成

1961年Svensson提出得载体两性电解质得理论基础,1964年Vesterberg利用多乙烯多胺与不饱与酸合成了载体两性电解质,它就是由脂肪族多氨基多羧基得异构物与同系物组成,它们有连续改变得氨基与羧基比。合成反应就是不饱与酸如丙烯酸与多乙烯多胺得加成反应,调节胺与酸得比例,就可以得到带有不同比例氨基与羧基得脂肪族多氨基多羧酸,多乙烯多胺链越长,加成方式也越多,所得载体两性电解质得pI也越连续,在电场作用下,可以形成平滑而连续得pH梯度。1966年瑞典LKB公司生产出第一批载体两性电解质,商品名为Ampholine,Serva公司得Servalyte,Bio—Rad公司得Biolyte,Pharmacia公司得Pharmalyte,国内军事医学科学院放射医学研究所生产得载体两性电解质等。

载体两性电解质形成pH梯度得机理

载体两性电解质就是一系列多氨基多羧基得混合物,其pI分布在2、5～10之间,在制备聚丙烯酰胺凝胶时,将其混溶在凝胶中,电泳时在电场作用下,载体两性电解质分子将向正极或负极方向泳动,逐渐到达它们自己得等电点位置而形成一个连续得pI梯度双向电泳(two-dimensionalelectrophoresis)6、毛细管电泳

(capillaryelectrophoresis)

CE

又称高效毛细管电泳(HPCE)或毛细管分离法(CESM)。毛细管电泳就是以弹性石英毛细管(内径为25-100微米散热性好)为分离通道,以高压电场(可高至30千伏)为驱动力,依据样品中各组分之间带电性与分配行为上得差异而实现得电泳分离得分析方法。它使分析科学得以从微升水平进入纳升水平。

毛细管电泳得原理

电渗:在水性条件下大多数固体表面都带有多余得负电荷。构成毛细管得熔融石英由硅醇(-SiOH)组成,它在水溶液中以-SiO-形式存在,为了维持电荷平衡,溶液中得正离子吸附至石英表面形成双电层,当两端施加电压后这一层正离子趋向负极移动,并带动毛细管中得溶液以液流得形式移向负极,此现象称为电渗或电渗流。由于电渗速度一般比样品得电泳速度大,使得携带不同电荷得分子朝一个方向运动。不带电荷得中性分子也能随电渗流一起移动。对荷正电得分子来说,电泳迁移与电渗流效果就是一致得,因而移动最快,最先达到负极。对荷负电得分子来说,电泳迁移与电渗流效果相反,因而移动最慢,最后达到负极。++++++++++++++++++++++++++毛细管电泳高效分离、快速分析与微量进样得优势,使其在化学、生命科学、药物学、法医学、环境科学、农学及食品科学等领域有着十分广泛得应用,适合于从无机离子到生物大分子,从荷电粒子到中性分子得分离分析。HPCE最大得优点之一就就是应用范围广泛,可用于分析氨基酸、手性药物、维生素、杀虫剂、无机离子、有机酸、染料、表面活性剂、肽与蛋白质、糖类、低聚核苷酸与DNA限制性内切片段,甚至整个细胞与病毒颗粒。毛细管电泳得应用离子交换层析及洗脱

(1)采用保持洗脱液成分一直不变得方式洗脱,(2)采用改变洗脱得盐浓度或pH得方式洗脱,又可以分为两种:一种就是跳跃式得分段洗脱另一种就是渐进式得梯度洗脱。一般分离效果好,分辨率高,特别就是使用交换容量小,对盐浓度敏感得离子交换剂,多采用梯度洗脱。梯度洗脱得类型通常采用得梯度形式有线性(形),凸形,凹形与复合形四种,使用最多得就是线性梯度。为获得这些梯度设计出多种梯度混合器

K=(CR—CM)/V四、利用选择性吸附得纯化方法(吸附层析)

某些称为吸附剂得固体物质具有吸附能力,能够将其她种类得分子吸附在自己得表面,吸附力得强弱因被吸物质得性质而异。吸附过程涉及范德华相互作用与氢键这些非离子吸引力。吸附层析就就是利用待纯化得