中医药防治动脉粥样硬化的系列研究

中医药防治动脉粥样硬化的系列研究南方医科大学贾钰华主要内容一、动物模型二、研究内容三、研究方法四、研究结果五、展望前景前言动脉粥样硬化（AS）是主要发生在全身大、中弹力血管处的慢性病变（粥样斑块）。AS与多种因素密切相关，其中脂质代谢异常、血管内皮损伤、炎症反应、氧化应激、病理性血管生成都是诱发AS的中心环节。血液流变学异常、血小板活化及血管内皮损伤是AS血的重要生物学表现。AS斑块是痰浊与血瘀凝结的结果。一、动脉粥样硬化斑块动物模型1.国家有关医学实验动物管理的有关法规是证候模型研究中动物选择的基本依据。现代医学动物实验学有关从动物生理特性，研究指标，实验技术操作，自然发病等方面选择动物的原理为证候模型研究中动物的选择所遵循。实验动物在遗传、微生物质量控制方面存在着单纯性与代表性的基本矛盾，即动物的品质越高，实验结果就越均一，但其代表性也越弱。从作为人类模型这一本质属性来说，实验动物质量的首要衡量标准是与人类的相似性，标准化必须服从于相似性。从标准化出发进行实验动物的遗传和微生物控制是错误的。2.建立与中医学相适应的，实证的实验动物评价、管理体系证候模型研究的动物选择应从中医角度考虑体质因素。证候模型研究的动物选择还应从中医角度考虑技术因素：猪的皮肤结构与人相似，适合制作温病模型观察汗出；猪的舌象与人相似适合于模型舌象观察；体形较大的动物适合于做按摩治疗研究；豚鼠耳蜗较为敏感，常用于“肾主耳”的研究。3.证候模型研究应尽量选择在其日常生活中就能出现相应证候的动物。遗传性证候模型由于具有生物学特性恒定，重复性好的特点，应更多地建立。如在病的基础上筛选出证候较一致的动物模型，如自发性遗传性糖尿病阴虚证中国田鼠(Cricetulusgriseus)，将健康中国田鼠在兄弟姐妹鼠间交配，第三、第四代时出现自发性遗传性糖尿病，发生率可达65～90%。4.动脉粥样硬化动物模型构建的方法5.AS痰浊血瘀证候现代生物学基础(1)动脉粥样硬化痰浊证候的生物学基础

脂质代谢紊乱——痰浊从痰证论治AS是具有中医特色的一种方法结合脂质代谢紊乱，尤其是HDL-C的胆固醇逆向转运作用，从细胞和分子水平对痰浊型AS的发病机制进行更深入的研究，将有助于揭示AS痰浊证候的微观生物学基础。(2)动脉粥样硬化血瘀证候的生物学基础血瘀证:血凝而不行、血泣则不通、凝血蕴里而不散等，说明血在脉中发生瘀滞的状态血行失度、血脉不通皆是产生AS血瘀证候根本原因。现代研究表明，血液流变学异常、血小板活化及血管内皮损伤是AS血瘀证候的重要生物学表现。内皮细胞损伤是血管病变的始动因素，内皮素(ET)是血管内皮细胞损伤特异性指标之一。ET、NO及二者的平衡，血栓素(TXA2)、前列腺素(PGI2)及二者间的平衡(TXA2／PGI2)，组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、组织型纤溶酶原激活剂抑制物(PAI)及二者的比值炎症病理和纤维化——血瘀证机制。研究证实在AS从早期内皮被修饰的脂质活化到最终的斑块破裂都有炎性反应的参与。如：AS发生时诸多细胞炎症因子的表达与核因子-κB(NF-κB)信号转导通路的开放有关（3）动脉粥样硬化痰浊血瘀证与组学技术高脂血症及AS不同痰瘀证候可能的血浆标志蛋白与不同的脏腑功能之间存在不同的关联组合。采用代谢组学技术，探讨痰瘀证候的动态演变、时相特点和由痰致瘀在代谢方面的变化。高脂血症前期以脂质代谢紊乱为特点，随着病程进展，参与血液凝固过程的乙酰糖蛋白出现，同时酮体及乳酸升高。我们的经验体会无论是大鼠还是小鼠，仅仅用高脂饲料喂养的方法，只能制造高脂血症模型（痰浊证），很难制作出AS斑块模型（痰浊血瘀证）；制作出AS斑块动物模型，虽然有多种方法，如球囊损伤法，但死亡率高，成本大，操作不易；用ApoE-/-小鼠+高脂饲料喂养的方法，成功率高，成本相对较低，操作相对容易，且符合痰浊血瘀证的特征。ApoE-/-小鼠+高脂饲料喂养的方法，是制作痰浊血瘀证AS斑块模型的理想方法。二、研究内容

AS的发生发展中具有诸多因素。本课题组近年来，采用在体与离体水平相结合的方法，使用中医药干预AS模型小鼠与细胞，从抑制氧化应激、炎症反应以及减少病理性血管生成等方面，进行防治AS的系列研究。冠心病等AS疾病属中医胸痹、心悸怔忡、心痛范畴。其病因病机是本虚标实。气虚、痰瘀互阻是重要的病理因素。痰瘀互结以致病，补气活血是主要防治方法。二、研究内容基于对冠心病等AS疾病病机的充分认识，在临床上采用中药复方定心方（DXR）治疗冠心病多年收到了良好疗效。DXR重用赤芍和丹参为君，活血化瘀、凉血止痛，取“去瘀生新”之义；以归心肝经之黄连、苦参为臣，解毒清热，泻火宁心；佐以三七、瓜蒌活血祛痰，茯苓、党参健脾益气，灵芝、酸枣仁养心安神；诸药合而共奏益气养心、活血解毒、清热祛痰之功效。二、研究内容二、研究内容近几年的研究内容主要有六个方面：一、定心方上调ApoE-/-小鼠PTEN表达抑制动脉粥样硬化形成的研究；二、定心方经Ang1-Tie2通路干预人脐静脉内皮细胞血管生成的实验研究；三、定心方通过调节PI3K/Akt信号通路减轻ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激损伤的机制；二、研究内容四、栀子苷通过miR-101/MKP-1/MAPK通路抑制动脉粥样硬化炎症的机制研究；五、栀子苷对动脉粥样硬化并发非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠炎症和氧化应激的影响；六、三七皂苷R1上调miR-146a水平和减轻ApoE-/-小鼠肝脏炎症损伤的研究三、研究方法1.在体水平实验动物：SPF级8周龄雄性ApoE-/-小鼠90只，8周龄雄性野生型C57BL/6J小鼠作为空白对照。饲养室温18～26℃，相对湿度55%左右，光照时间为12h。饲养笼具及引水瓶定期消毒。小鼠分笼饲养，每笼3～4只。高脂饲料（0.15%胆固醇，21%猪油，78.85%原粮）由广东省医学实验动物中心配制。小鼠分组：雄性ApoE-/-小鼠，随机分为9组，每组10只。分别为模型组，辛伐他汀组，DXR低、中、高剂量组，栀子苷组，三七皂苷低、中、高剂量组，所有小鼠均高脂饲料喂养，并以同周龄雄性C57BL/6J小鼠作为空白对照组。三、研究方法DXR低、中、高剂量组分别以9.30g/kg、18.59g/kg、37.18g/kg药液灌胃，辛伐他汀组以5mg/kg药液灌胃，栀子苷以50mg/kg药液灌胃，三七皂苷R1低、中、高剂量组分别为12.5mg/kg、25mg/kg、50mg/kg，腹腔注射给药，其他组给予等剂量生理盐水灌胃。各组小鼠自由饮水，根据小鼠体重(每两周测量1次)，以校正给药量，药液灌胃均每日1次，连续12周。三、研究方法三、研究方法2.离体水平人脐静脉内皮细胞（HUVEC）购自于CascadeBiologics公司，细胞培养用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃，5%的CO2饱和湿度条件下常规培养，2~3d传代一次，实验采用对数生长期的细胞。三、研究方法含药血清的制备实验分组：以含10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液培养人脐静脉内皮细胞18h，待细胞贴壁后，分为5组：空白对照组、模型组、DXR高、中、低剂量组。空白对照组加入10％FBS的DMEM培养液，其余各组加入10％FBS的DMEM培养液+ox-LDL，终浓度为100ug/ml。以上各组共同继续培养24h，弃去上清后，空白对照组加入含15％空白大鼠血清的DMEM培养液，模型组加入10％FBS的DMEM培养液，定心方高中低剂量组分别加入20%、15%、5%含DXR含药血清的DMEM培养液，共同培育24h后收集细胞。生化检测HE、Masson染色免疫组化RT-qPCRWesternBlot

ELISA

三、研究方法三、研究方法细胞划痕实验内皮细胞迁移实验鸡胚尿囊膜实验

小管形成实验1、定心方上调ApoE-/-小鼠PTEN表达抑制动脉粥样硬化形成的研究①DXR给药组血脂水平较模型组明显降低，表明DXR有降脂作用；②模型组小鼠血清中总超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，总抗氧化能力较空白对照组明显降低，而丙二醛水平明显升高。DXR治疗后血清中总超氧化物歧化酶，谷胱甘肽过氧化物酶，总抗氧化能力升高，丙二醛水平降低，表明DXR有抑制ApoE-/-小鼠氧化应激的作用；

四、研究结果③与空白对照组小鼠相比，所有ApoE-/-小鼠均有斑块形成。经不同剂量DXR治疗后主动脉病变减轻，DXR高剂量组管腔狭窄程度减轻最为明显，斑块面积最小；④模型组小鼠主动脉PTEN水平较空白对照组明显降低，而经过辛伐他汀及DXR不同剂量治疗后均可升高PTEN水平。

四、研究结果2、定心方经Ang1-Tie2通路干预人脐静脉内皮细胞血管生成的实验研究①受DXR干预小鼠的斑块内CD34标记的小血管数目明显减少，证明DXR具有抑制小鼠血管生成的作用；

四、研究结果注：A.空白组B.模型组C.辛伐他汀组D.DXR低剂量组E.DXR中剂量组F.DXR高剂量组（200倍光镜下视野）②DXR中剂量组和高剂量组对ox-LDL诱导的血管内皮细胞的迁移具有抑制作用。DXR含药血清组也具有降低血管内皮细胞在体外分化成管状结构的能力；③受DXR含药血清干预的HUVEC中的Ang1蛋白和Tie2蛋白表达量上调，与血管生成相关的VEGF蛋白表达量下降。说明DXR含药血清可以激活人脐静脉内皮细胞中的Ang1-Tie2通路，进而调控下游指标VEGF，实现对血管生成的调控；

四、研究结果④鸡胚尿囊膜实验证明，受DXR含药血清干预的鸡胚组形成的一级血管与二级血管数量显著低于模型组。

四、研究结果

3、定心方通过调节PI3K/Akt信号通路减轻ox-LDL诱导的HUVEC氧化应激损伤的机制①DXR可显著降低MMP9表达与MMP9/TIMP1比值，并上调TIMP1表达；②DXR可促进ox-LDL诱导的HUVEC分泌NO及SOD，起到抗氧化应激作用；③DXR各组细胞的p-PI3K、p-Akt蛋白表达均显著降低。

四、研究结果4、栀子苷通过miR-101/MKP-1/MAPK通路抑制动脉粥样硬化炎症的机制研究

①栀子苷降低小鼠血脂血糖水平，调控糖脂代谢紊乱；②栀子苷减小动脉粥样硬化小鼠体内斑块大小，减缓纤维斑块的发展；③栀子苷显著降低小鼠血清中炎症因子如TNF-α、IL-6的表达；④栀子苷可以上调MKP-1表达，降低p38的活化程度；⑤栀子苷显著下调miR-101的转录水平

四、研究结果5、栀子苷对动脉粥样硬化并发非酒精性脂肪肝ApoE-/-小鼠炎症和氧化应激的影响①栀子苷能够有效降低ApoE-/-小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基酶水平；②栀子苷能够降低小鼠肝脏中TNF-α、IL-6水平，具有抑制炎症及减轻肝损伤的作用；

四、研究结果③栀子苷显著降低肝脏中丙二醛水平，升高总超氧化物歧化酶水平。④HE染色表明栀子苷能够有效减少AS斑块面积，同时能够一定程度抑制肝脏脂肪变性。

四、研究结果

6、三七皂苷R1上调miR-146a水平和减轻ApoE-/-小鼠肝脏炎症损伤的研究

①模型组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基酶含量显著高于空白对照组，使用中、高剂量三七皂苷R1干预后，小鼠血清丙氨酸氨基转移酶与天冬氨酸氨基酶的含量显著降低；②肝脏组织形态学结果也表明，与模型组比较，三七皂苷R1能明显减轻AS小鼠肝细胞的脂肪变性，改善肝功能；

四、研究结果③三七皂苷R1干预小鼠后，TNF-α和IL-6均显著下降，且高剂量组疗效更为显著，表明三七皂苷R1能明显抑制AS炎症因子的表达；④三七皂苷R1及辛伐他汀干预后进一步升高肝脏miR-146a水平，从而发挥其抑制炎症的作用。这可能是三七皂苷R1减轻AS小鼠肝损伤及炎症反应的重要分子机制。

四、研究结果

中医药因其独特的辨证论治理论体系及全面调节机体机能的特色，在干预AS的研究方面取得了一定的进展。