专题二微生物的培养复习

专题二微生物的培养复习(1)固体培养基、液体培养基和半固体培养基①固体培养基:(观察菌落和分离提纯微生物)在一般培养温度下呈固体状态得培养基。一类就是用天然得固体状物质制成得,如用马铃薯块、麸皮、米糠、豆饼粉、花生饼粉制成得培养基,酒精厂、酿造厂等常用这种培养基;另一类就是在液体中添加凝固剂而制成得,如实验室中常用得琼脂固体斜面和固体平板培养基。这种培养基广泛用于微生物得分离、鉴定、保藏、计数及菌落特征得观察等。②液体培养基或培养液或发酵液:(工业大规模培养)呈液体状态得培养基。液体培养基因营养物质分布均匀,与菌体表面接触充分,还能大量溶解微生物得代谢产物等优点,广泛用于微生物得生理、代谢研究以及大规模得工业化生产中。③半固体培养基:(观察微生物得运动)

加入少量得凝固剂(如0、2％～0、5％得琼脂)而制成得培养基。这种培养基常用于观察细菌得运动、厌氧菌得分离和菌种鉴定等。(2)天然培养基和合成培养基①天然培养基:(工业生产降低成本)主要取自动物体液或从动物组织分离提取。其优点就是营养成分丰富,培养效果良好,缺点就是成分复杂,来源受限。天然培养基/液得种类很多,包括生物性液体(如血清);组织浸液(如胚胎浸液);凝固剂(如血浆)等。②合成培养基:(菌种得分类,鉴定,营养、代谢,遗传、鉴定和生物测定等定量要求较高得研究)就是通过顺序加入准确称量得高纯度化学试剂与蒸馏水配制而成得。其所含得成分(包括微量元素在内)以及她们得量都就是确切可知得。关于选择培养基(1)基本得培养基通过加青霉素,实现分离纯化酵母菌、霉菌;

(2)加高浓度得食盐分离纯化金黄色葡萄球菌(有高度得耐盐性,可在10~15%NaCl肉汤中生长)

(3)无氮培养基可分离纯化固氮菌(固氮细菌)。

(4)不含有机碳得培养基可分离纯化自养型细菌如硝化细菌。

(二)培养基配制原则:(1)目得要明确:根据微生物得种类、培养目得等确定配制培养基得种类,因为不同得微生物对培养物质得需求不同。(2)营养要协调:注意各种营养物质得浓度和比例。(3)pH要适宜:各种微生物适宜生长得pH范围不同。细菌pH为:6、5-7、5(偏碱);放线菌pH为:7、5-8、5;真菌pH为:5、0-6、0(偏酸)。微生物需要得四大类营养要素物质就是:(三)培养基得构成1、碳源2、氮源3、无机盐4、水凡就是能为微生物提供所需碳元素得营养物质。①无机碳源:CO2;NaHCO3;碳酸盐等②有机碳源:糖类、脂肪酸、蛋白质、花生粉饼、石油等⑴概念⑵来源:⑶不同微生物所利用得碳源不同:1、微生物得碳源异养型微生物得碳源为:含碳有机物(有机碳)自养型微生物得碳源为:含碳无机物(无机碳)①无机氮源:N2、NH4+氨盐、NO3-硝酸盐、NH3。②有机氮源:尿素、牛肉膏、蛋白胨、氨基酸等凡就是能够为微生物提供N元素得营养物质。2、微生物得氮源⑴概念:⑵来源:⑶固氮微生物所利用得氮源就是:3、特殊要求培养基还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质,例如:生长因子(微生物生长不可缺少得微量有机物)如维生素、某些氨基酸、碱基)以及氧气、二氧化碳、渗透压等得要求。氮气牛肉膏为微生物提供碳源、氮源、能源、磷酸盐和维生素,蛋白胨主要提供氮源和维生素。耐高温需保持干燥得物品,160～170℃1～2小时接种环、接种针等金属用具70~75℃、30min80℃、15min100℃、5~6min消毒灭菌定义方法较为温和理化方法,杀死部分有害菌体(不包括芽孢、孢子)强烈得理化方法,杀死所有微生物(包括芽孢、孢子)煮沸消毒法巴氏消毒法化学药剂紫外线灼烧灭菌干热灭菌酒精、氯气、石炭酸等高压蒸汽灭菌培养基,100KPa、121℃、15～30min2、消毒与灭菌:1000ml牛肉膏蛋白胨培养基的配方H2O定容至1000mlNacl5g蛋白胨10g牛肉膏5g琼脂20.0g三、大肠杆菌得纯化培养:㈠制备牛肉膏蛋白胨固体培养基1、计算:培养基用量依配方计算各成分得用量2、称量:3、溶化:牛肉膏黏稠,用称量纸称取牛肉膏、蛋白胨易吸潮,要快、加盖牛肉膏、称量纸、少量水加热溶解→取纸→蛋白胨、NaCl→琼脂→补水定容4、调pH、分装、封口5、灭菌:6、倒平板:培养基、培养皿由一个细胞繁殖而来得肉眼可见得子细胞群体,就就是菌落大家学习辛苦了，还是要坚持继续保持安静倒平板约50℃防止皿盖上得水珠落入培养基,造成污染灼烧灭菌,防止瓶口得微生物污染培养基1、培养基灭菌后,需要冷却到50℃左右时,才能用来倒平板。您用什么办法来估计培养基得温度？问题讨论答:可以用手触摸盛有培养基得锥形瓶,感觉锥形瓶得温度下降到刚刚不烫手时,就可以进行倒平板了。2、为什么需要使锥形瓶得瓶口通过火焰？答:通过灼烧灭菌,防止瓶口得微生物污染培养基。3、平板冷凝后,为什么要将平板倒置？4、在倒平板得过程中,如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间得部位,这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？答:平板冷凝后,皿盖上会凝结水珠,凝固后得培养基表面得湿度也比较高,将平板倒置,既可以使培养基表面得水分更好地挥发,又可以防止皿盖上得水珠落入培养基,造成污染。答:空气中得微生物可能在皿盖与皿底之间得培养基上滋生,因此最好不要用这个平板培养微生物。㈡纯化大肠杆菌:1、纯化得方法:(1)平板划线法:通过接种环在琼脂固体培养基表面连续画线操作,将聚集得菌种逐步稀释分散到培养基得表面,在数次画线后培养,可以分离到由一个细胞繁殖而来得子细胞群体,这就就是菌落。(2)稀释涂布平板法:将菌液进行一系列得梯度稀释,然后将不同稀释度得菌液分别涂布到琼脂固体培养基得表面进行培养。在稀释度足够高得菌液里,聚集在一起得微生物将被分散成单个细胞,从而在培养基表面形成单个菌落。将接种环放在火焰上灼烧,直到接种环_______在_______旁冷却接种环,并打开棉塞将试管口通过火焰、将已______得接种环伸入菌液中蘸取一环菌液左手将皿盖打开一条缝隙,右手将沾有菌种得接种环迅速伸入平板内,划__________条平行线,盖上皿盖。注意不要划破培养基。、将试管通过火焰,并塞上棉塞火焰冷却三至五灼烧接种环,待其冷却后,从第一区域划线得_______开始往第二区域内划线。重复以上操作,在三、四、五区域内划线。注意不要将最后一区得划线与第一区相连。末端烧红将平板_____放入培养箱中培养。

倒置问题讨论1、为什么在操作得第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时,仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答:操作得第一步灼烧接种环就是为了避免接种环上可能存在得微生物污染培养物;每次划线前灼烧接种环就是为了杀死上次划线结束后,接种环上残留得菌种,使下一次划线时,接种环上得菌种直接来源于上次划线得末端,从而通过划线次数得增加,使每次划线时菌种得数目逐渐减少,以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环,能及时杀死接种环上残留得菌种,避免细菌污染环境和感染操作者。2、在灼烧接种环之后,为什么要等其冷却后再进行划线？答:以免接种环温度太高,杀死菌种。3、在作第二次以及其后得划线操作时,为什么总就是从上一次划线得末端开始划线？答:划线后,线条末端细菌得数目比线条起始处要少,每次从上一次划线得末端开始,能使细菌得数目随着划线次数得增加而逐步减少,最终能得到由单个细菌繁殖而来得菌落。6支试管，分别加入9ml无菌水1ml1011ml1021ml1031ml1041ml1051ml106⑵稀释涂布平板法:a、梯度稀释菌液:菌液微量移液器2、菌种培养:3.实验结果观察将接种后得培养基和一个未接种得培养基放入37℃恒温箱中培养12h～24h后,观察并记录四、菌种得保藏:1、临时保藏:试管固体斜面培养基上等菌落长成后放入4℃冰箱保存2、长期保存:菌种易被污染、变异甘油管藏1ml甘油灭菌＋1ml菌液－20℃b、涂布平板:不超过0、1ml滴灼试涂稀释103倍稀释104倍稀释105倍课题2土壤中分解尿素得细菌得分离与计数一、课题背景1、尿素得利用尿素就是一种重要得农业氮肥。尿素不能直接被农作物吸收。土壤中得细菌将尿素分解成氨之后才能被植物利用。2、细菌利用尿素得原因土壤中得细菌分解尿素就是因为她们能合成脲酶尿素脲酶+CO2NH3+H2O4、课题目得①从土壤中分离出能够分解尿素得细菌②统计每克土壤样品中究竟含有多少这样得细菌15.0g琼脂1.0g尿素10.0g葡萄糖0.2gMgSO4`7H2O2.1gNaH2PO41.4gKH2PO43、土壤中分解尿素得细菌得分离与计数所需培养基:①从物理性质看此培养基属于哪类？固体培养基②在此培养基中哪些作为碳源、氮源？碳源:葡萄糖、尿素氮源:尿素培养基得氮源为尿素,只有能合成脲酶得微生物才能分解尿素,以尿素作为氮源。缺乏脲酶得微生物由于不能分解尿素,缺乏氮源而不能生长发育繁殖,而受到抑制,所以用此培养基就能够选择出分解尿素得微生物。5、培养基选择分解尿素得微生物得原理1、显微镜直接计数:利用血球计数板,在显微镜下计算一定容积里样品中微生物得数量。㈡、统计菌落数目:不能区分死菌与活菌;不适于对运动细菌得计数;需要相对高得细菌浓度;个体小得细菌在显微镜下难以观察;缺点2、间接计数法(活菌计数法)⑴原理:在稀释度足够高时,微生物在固体培养基上所形成得一个菌落就是由一个单细胞繁殖而成得,即一个菌落代表原先得一个单细胞。⑵常用方法:稀释涂布平板法。每克样品中得菌落数＝(C÷V)×M其中,C代表某一稀释度下平板上生长得平均菌落数,V代表涂布平板时所用得稀释液得体积(ml),M代表稀释倍数。注意事项①为了保证结果准确,一般选择菌落数在30——300得平板上进行计数。②为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上得平皿中,经涂布,培养计算出菌落平均数。③统计得菌落往往比活菌得实际数目低。设置对照得主要目得就是排除实验组中非测试因素对实验结果得影响,提高实验结果得可信度。㈢、设置对照:二、实验得具体操作

㈠、土壤取样

从肥沃、湿润得土壤中取样。先铲去表层土3cm左右,再取样,将样品装入事先准备好得信封中。◆取土样用得小铁铲和盛土样得得信封在使用前都要灭菌。㈡、制备培养基:制备以尿素为唯一氮源得选择培养基。◆应在火焰旁称取土壤10g。◆在稀释土壤溶液得过程中,每一步都要在火焰旁进行[三]样品得稀释㈣、取样涂布◆实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。㈣、取样涂布◆分离不同得微生物采用不同得稀释度稀释倍数目得细菌104、105、106保证获得菌落数在30～300之间、适于计数得平板放线菌103、104、105真菌102、103、104原因:不同微生物在土壤中含量不同㈤、微生物得培养与观察在菌落计数时,每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时得记录作为结果,以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落得数目。

培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌:30～37℃培养1～2d放线菌:25～28℃培养5～7d霉菌:25～28℃得温度下培养3～4d。◆如果得到了2个或2个以上菌落数目在30——300得平板,则说明稀释操作比较成功,并能够进行菌落得计数,如果同一稀释倍数得三个重复得菌落数相差较大,表明试验不精确,需要重新实验。课题延伸对分离得菌种作进一步得鉴定,还需要借助生物化学得方法。2、在细菌分解尿素得化学反应中,细菌合成得脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基得碱性增强,pH升高。因此,我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应就是否发生。课题延伸对分离得菌种作进一步得鉴定,还需要借助生物化学得方法。2、在细菌分解尿素得化学反应中,细菌合成得脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基得碱性增强,pH升高。因此,我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应就是否发生。3、在以尿素为唯一氮源得培养基中加入酚红指示剂。培养某种细菌后,如果pH升高,指示剂将变红,说明该细菌能够分解尿素。2、纤维素酶

纤维素酶就是一种复合酶,一般认为她至少包括三种组分,即C1酶(外切酶)、CX酶(内切酶)和葡萄糖苷酶,前两种酶使纤维素分解成纤维二糖,第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。纤维二糖C1酶、Cx酶葡萄