小鼠抗人GP73单克隆抗体制备及鉴定：方法、影响因素与应用前景

一、引言1.1研究背景与意义肝脏作为人体至关重要的代谢和解毒器官，一旦发生病变，如肝炎、肝硬化、肝癌等，会严重威胁人类的健康。根据世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）估计，2000年全世界肝癌发病人数为56.4万，死亡54.9万人，而我国肝癌发病人数30.6万，死亡30.0万人，约占全世界的50％，我国现有乙肝病毒携带者1.2亿左右，约占世界乙肝病毒携带者的1/3；有症状的慢性乙肝患者2000万人，另外我国还有肝硬化患者360万人。由于众多的肝病患者和肝癌高危人群，我国的肝细胞癌发病率居高不下。因此，对肝脏疾病的早期诊断和治疗显得尤为重要。高尔基体蛋白73（GolgiProtein73，GP73），是一种II型高尔基跨膜蛋白，也是一种新发现的与肝病病程相关的蛋白。在正常生理状态下，GP73在肝细胞中表达量极少，主要在胆管上皮细胞中表达。然而，当肝细胞受到病毒感染、发生炎症或癌变等病理变化时，GP73的表达会显著上调。研究表明，在乙肝、丙肝等病毒性肝炎患者体内，GP73水平会随着病毒的活跃复制而升高；在肝硬化患者中，随着肝纤维化程度的加重，血清GP73浓度也逐渐上升；特别是在肝癌患者中，GP73的表达水平呈现出大幅度的提升，且与肝癌的分期、预后等密切相关。如在一项针对60个肝癌患者和30个非肝癌患者的血清样本分析中，GP73单克隆抗体对肝癌的敏感性为78.33%，特异性为90.00%，对于早期肝癌的敏感性更高，可达85.71%。正是由于GP73在肝脏疾病进程中的这种特异性表达变化，使得它成为极具潜力的肝脏疾病诊断和监测的生物标志物。通过检测GP73的表达水平，医生能够更准确地判断肝脏疾病的类型、严重程度以及病情发展趋势，从而为患者制定更为精准有效的治疗方案。单克隆抗体技术自问世以来，凭借其特异性强、灵敏度高、可大量制备且性质均一稳定等显著优势，在疾病诊断、治疗以及基础研究等众多领域得到了广泛应用。在肝脏疾病诊断领域，针对GP73制备的单克隆抗体，能够特异性地识别并结合GP73抗原，从而实现对样本中GP73的高灵敏度、高特异性检测。这不仅有助于提高肝脏疾病早期诊断的准确性，还能为肝癌的早期筛查、分期以及预后评估提供强有力的工具。例如，利用基于GP73单克隆抗体的荧光ELISA系统，能够准确确定肝癌患者的GP73水平，为肝癌的早期诊断和病情监测提供关键依据。本研究聚焦于小鼠抗人GP73单克隆抗体的制备与鉴定，具有重要的理论和实践意义。从理论层面来看，深入研究GP73单克隆抗体的制备与鉴定过程，能够加深我们对GP73蛋白结构与功能关系的理解，为进一步探究肝脏疾病的发病机制提供新的视角和思路。从实践应用角度出发，成功制备并鉴定出高效、特异性强的小鼠抗人GP73单克隆抗体，将为开发新型的肝脏疾病诊断试剂和方法奠定坚实基础，有望显著提高肝脏疾病的早期诊断率，为患者的早期治疗和康复赢得宝贵时间，具有重要的临床应用价值和社会经济效益。1.2国内外研究现状在国外，对GP73的研究起步较早，自2000年Kladney等首次发现GP73并揭示其在肝脏疾病中的表达变化后，众多科研团队围绕GP73展开了深入探索。在单克隆抗体制备方面，已经有多种成熟的技术路线被应用，如传统的杂交瘤技术，通过将免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出能够稳定分泌抗GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞株。这些单克隆抗体被广泛应用于基础研究中，用于探究GP73在肝脏生理病理过程中的作用机制，如研究GP73在肝癌细胞增殖、迁移和侵袭过程中的分子调控网络。在临床应用研究上，国外学者利用GP73单克隆抗体开发了多种检测方法，如化学发光免疫分析法、免疫荧光法等，用于肝癌及其他肝脏疾病的诊断和病情监测，并取得了一定的成果，部分检测方法已进入临床试验阶段。国内在GP73单克隆抗体领域的研究也取得了显著进展。科研人员在优化抗体制备工艺上投入了大量精力，通过改进抗原制备方法、调整免疫方案以及优化杂交瘤细胞筛选流程等手段，提高了单克隆抗体的质量和产量。在临床研究方面，国内开展了多项大规模的临床样本检测实验，进一步验证了GP73单克隆抗体在肝脏疾病诊断中的价值，如在一项针对中国人群的多中心研究中，纳入了上千例不同类型肝脏疾病患者及健康对照，结果显示GP73单克隆抗体检测在肝癌早期诊断中的灵敏度和特异性均优于传统指标甲胎蛋白（AFP），为肝癌的早期筛查提供了新的有力工具。同时，国内还积极探索GP73单克隆抗体与其他生物标志物联合检测的模式，以提高肝脏疾病诊断的准确性和全面性。尽管国内外在GP73单克隆抗体的研究和应用方面取得了诸多成果，但目前仍存在一些不足之处。在单克隆抗体的性能上，部分抗体的亲和力和稳定性还有提升空间，这可能影响检测的灵敏度和重复性；在检测方法上，现有的检测技术虽然能够实现对GP73的定量检测，但检测流程较为复杂，检测时间较长，难以满足临床快速诊断的需求；在临床应用方面，GP73单克隆抗体检测尚未形成统一的标准化流程和参考区间，不同实验室的检测结果可比性较差，限制了其在临床实践中的广泛推广应用。本研究的创新点在于，尝试采用新型的抗原修饰策略和细胞融合技术，期望制备出亲和力更高、特异性更强的小鼠抗人GP73单克隆抗体。在抗体鉴定过程中，引入先进的蛋白质组学和生物信息学技术，全面深入地分析抗体的结构和功能特性，为抗体的优化提供更精准的依据。此外，本研究还将致力于开发基于该单克隆抗体的快速、简便、高灵敏度的检测方法，并通过大规模的临床样本验证，建立标准化的检测流程和参考区间，为GP73单克隆抗体在肝脏疾病临床诊断中的广泛应用奠定坚实基础，补充现有研究在这些方面的不足。二、小鼠抗人GP73单克隆抗体制备2.1实验材料与仪器实验动物：6-8周龄雌性BALB/c小鼠，购自[具体动物供应商名称]。BALB/c小鼠属于近交系小鼠，其遗传背景高度纯合，个体间差异小，免疫反应一致性高。在单克隆抗体制备实验中，这种遗传稳定性能够确保小鼠在接受相同抗原免疫后，产生较为一致的免疫应答，有利于后续筛选出稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。同时，BALB/c小鼠对多种抗原具有良好的免疫原性，能够高效地产生针对目标抗原的抗体，是单克隆抗体制备中常用的实验动物。细胞株：SP2/0骨髓瘤细胞株，由本实验室保存。SP2/0细胞是小鼠骨髓瘤细胞，具有在体外无限增殖的特性。在单克隆抗体制备过程中，将其与免疫小鼠的脾细胞融合，形成的杂交瘤细胞既能继承脾细胞分泌特异性抗体的能力，又能获得SP2/0细胞无限增殖的特点，从而实现单克隆抗体的大量制备。试剂：抗原：重组人GP73蛋白，购自[蛋白供应商名称]。该重组蛋白经过纯化和鉴定，纯度高、活性好，能够有效刺激小鼠的免疫系统产生特异性抗体。其氨基酸序列和空间结构与天然人GP73蛋白高度相似，确保了制备的单克隆抗体能够准确识别和结合天然GP73抗原，提高抗体的特异性和实用性。弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂：购自[佐剂供应商名称]。在免疫小鼠时，弗氏完全佐剂用于初次免疫，它能够增强抗原的免疫原性，促进抗原在体内的缓慢释放，刺激机体产生强烈的免疫反应；弗氏不完全佐剂用于后续加强免疫，进一步增强小鼠的免疫应答，提高抗体的产量和质量。细胞培养基：RPMI-1640培养基（购自[培养基供应商名称]），添加10%胎牛血清（购自[胎牛血清供应商名称]）、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素。RPMI-1640培养基为细胞提供了适宜的营养环境，胎牛血清中含有丰富的生长因子、激素和营养物质，能够促进细胞的生长和增殖；青霉素和链霉素则用于防止细胞培养过程中的细菌污染，保证细胞培养的无菌环境。细胞融合试剂：聚乙二醇（PEG，分子量为4000，购自[PEG供应商名称]），作为细胞融合剂，能够促进脾细胞和骨髓瘤细胞的细胞膜融合，形成杂交瘤细胞。其作用原理是通过改变细胞膜的表面电荷和流动性，使两种细胞更容易相互靠近并融合在一起。筛选培养基：HAT培养基（含次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷，购自[HAT培养基供应商名称]），用于杂交瘤细胞的选择性培养。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞由于缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），不能利用培养基中的次黄嘌呤进行核酸合成，而被氨基蝶呤阻断了正常的核酸合成途径，从而无法生长；未融合的脾细胞在体外存活时间有限，也会逐渐死亡；只有融合的杂交瘤细胞，由于获得了脾细胞的HGPRT，能够在HAT培养基中利用次黄嘌呤进行核酸合成，从而存活并增殖。其他试剂：磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4，自制），用于细胞洗涤、抗原稀释等操作，维持溶液的pH稳定，为细胞和生物分子提供一个接近生理状态的环境；二甲基亚砜（DMSO，购自[DMSO供应商名称]），在细胞冻存时作为冷冻保护剂，能够降低细胞在冷冻过程中的冰晶损伤，提高细胞复苏后的存活率。仪器：CO₂培养箱：[品牌及型号]，为细胞培养提供适宜的温度（37℃）、湿度（95%）和CO₂浓度（5%）环境，维持细胞的正常生长和代谢。其中，CO₂能够调节培养基的pH值，使其保持在细胞生长所需的适宜范围内。超净工作台：[品牌及型号]，提供一个无菌的操作环境，防止外界微生物污染实验材料和细胞，确保实验的准确性和可靠性。通过过滤空气，去除空气中的尘埃和微生物，为实验操作提供一个洁净的空间。高速离心机：[品牌及型号]，用于细胞离心、蛋白质分离等操作。在细胞融合过程中，通过离心使脾细胞和骨髓瘤细胞充分混合，提高融合效率；在蛋白质纯化过程中，利用不同离心速度和时间，分离出目标蛋白和杂质。酶标仪：[品牌及型号]，用于检测ELISA实验中的吸光度值，定量分析抗体的效价和特异性。其工作原理是通过检测特定波长下的光吸收强度，反映样品中抗原-抗体反应的程度，从而实现对抗体性能的评估。倒置显微镜：[品牌及型号]，用于观察细胞的形态、生长状态和融合情况。在细胞培养过程中，实时监测细胞的生长情况，及时发现细胞的异常变化，如细胞形态改变、生长速度减慢等；在细胞融合后，观察杂交瘤细胞的形成和生长情况，筛选出具有良好生长状态的杂交瘤细胞克隆。2.2GP73抗原的制备与纯化2.2.1GP73基因的获取与表达载体构建获取GP73基因是整个实验的关键起始步骤。首先，从人肝癌细胞系HepG2中提取总RNA，这是因为HepG2细胞中GP73基因表达相对较高，能够为后续的基因扩增提供丰富的模板。提取过程采用Trizol试剂法，该方法利用Trizol试剂中的异硫氰酸胍和苯酚等成分，能够迅速裂解细胞，使核酸和蛋白质分离，同时有效抑制RNA酶的活性，从而保证提取的RNA的完整性和纯度。提取得到的总RNA经琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到清晰的28S和18SrRNA条带，且28SrRNA条带的亮度约为18SrRNA条带的两倍，表明RNA质量良好，无明显降解，可用于后续实验。以提取的总RNA为模板，通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）技术扩增GP73基因。在RT-PCR过程中，首先利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA，逆转录体系中包含总RNA、逆转录引物、逆转录酶、dNTPs以及缓冲液等成分，反应条件为42℃孵育60分钟，随后95℃加热5分钟使逆转录酶失活。接着以逆转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，根据GenBank中公布的GP73基因序列（登录号：[具体登录号]），设计特异性引物，引物序列为：上游引物5'-[具体序列]-3'，下游引物5'-[具体序列]-3'。引物设计遵循碱基互补配对原则，同时考虑引物的长度、Tm值、GC含量等因素，以确保引物具有良好的特异性和扩增效率。PCR扩增体系包括cDNA模板、上下游引物、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及PCR缓冲液等，扩增条件为：95℃预变性5分钟；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分钟，共进行35个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在预期大小位置（约[X]bp）出现明亮的条带，与理论值相符，表明成功扩增出GP73基因。将扩增得到的GP73基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上。在进行连接反应前，先使用限制性内切酶NcoI和XhoI对pET-28a(+)载体和GP73基因PCR产物进行双酶切处理。酶切反应体系包含载体或PCR产物、限制性内切酶、缓冲液等，37℃孵育3小时，使酶切反应充分进行。酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，利用凝胶回收试剂盒回收目的片段，确保回收的片段纯度高、完整性好。将回收的GP73基因片段与同样经双酶切处理的pET-28a(+)载体在T4DNA连接酶的作用下进行连接反应，连接体系中包含载体片段、基因片段、T4DNA连接酶、缓冲液等，16℃连接过夜。连接反应完成后，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中。转化过程如下：将连接产物加入到冰浴的DH5α感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟；然后42℃热激90秒，迅速置于冰浴中2分钟；加入预热的LB液体培养基，37℃振荡培养1小时，使细菌恢复生长并表达抗性基因。将转化后的菌液涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时，待菌落长出后，随机挑取单菌落进行菌落PCR鉴定和双酶切鉴定。菌落PCR鉴定时，以挑取的菌落为模板，使用与构建载体时相同的引物进行PCR扩增，扩增条件与之前的PCR扩增条件相同，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若在预期位置出现条带，则初步判断为阳性克隆。对初步鉴定为阳性的克隆进行双酶切鉴定，酶切体系和条件与之前的双酶切相同，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，若出现与预期大小相符的载体片段和GP73基因片段，则进一步确认重组表达载体构建成功。将鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序验证，测序结果与GenBank中公布的GP73基因序列进行比对，若完全一致，则表明成功构建了重组表达载体pET-28a(+)-GP73。2.2.2原核表达与蛋白纯化将构建成功的重组表达载体pET-28a(+)-GP73转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，以实现GP73蛋白的原核表达。转化方法与转化DH5α感受态细胞类似，将重组质粒加入到冰浴的BL21(DE3)感受态细胞中，冰浴、热激、复苏后，涂布在含有卡那霉素的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑取单菌落接种到含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养过夜，进行种子培养。次日，按1:100的比例将种子液转接至新鲜的含有卡那霉素的LB液体培养基中，继续培养至菌体OD600值达到0.6-0.8，此时菌体处于对数生长期，生长状态良好，适合进行诱导表达。向培养体系中加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），25℃、180rpm诱导表达16小时。IPTG能够诱导大肠杆菌表达外源基因，其作用机制是IPTG作为乳糖操纵子的诱导物，与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生改变，从而无法与操纵基因结合，解除对基因转录的抑制，启动外源基因的表达。诱导表达结束后，收集菌体，进行超声破碎。将菌体悬浮于适量的PBS缓冲液中，在冰浴条件下进行超声破碎，超声参数设置为：功率200W，超声3秒，间隔5秒，总时间30分钟。超声破碎的目的是使细胞破裂，释放出胞内的蛋白质。破碎后的菌液经12000rpm、4℃离心30分钟，分别收集上清和沉淀，进行SDS-PAGE电泳分析，以确定GP73蛋白的表达形式。SDS-PAGE电泳结果显示，在约[X]kDa处出现特异性条带，与预期的GP73蛋白大小相符，且蛋白主要以可溶性形式存在于上清中。利用镍离子亲和层析柱对上清中的GP73蛋白进行纯化。由于重组表达载体pET-28a(+)上带有His标签，His标签能够与镍离子亲和层析柱上的镍离子特异性结合，从而实现对GP73蛋白的分离纯化。首先用平衡缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，10mM咪唑）平衡镍离子亲和层析柱，流速为1mL/min，平衡3-5个柱体积，使柱子达到稳定状态。然后将超声破碎后的上清液缓慢上样到平衡好的柱子上，流速为0.5mL/min，上样完成后，用平衡缓冲液继续冲洗柱子，直至流出液的OD280值接近基线，以去除未结合的杂质。接着用洗脱缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，300mMNaCl，250mM咪唑）洗脱目的蛋白，流速为1mL/min，收集洗脱峰。咪唑能够与His标签竞争结合镍离子，随着咪唑浓度的升高，与镍离子结合的His标签逐渐被洗脱下来，从而实现目的蛋白的洗脱。收集的洗脱液经SDS-PAGE电泳检测，在约[X]kDa处出现单一的条带，表明GP73蛋白得到了有效纯化。将纯化后的GP73蛋白用透析缓冲液（50mMTris-HCl，pH8.0，150mMNaCl）进行透析，4℃透析过夜，以去除蛋白溶液中的咪唑和其他杂质，得到高纯度的GP73蛋白，用于后续的小鼠免疫实验。2.3动物免疫与细胞融合2.3.1免疫小鼠选取6-8周龄雌性BALB/c小鼠，在正式免疫前，先将小鼠置于动物房适应环境1周，期间自由进食和饮水，维持动物房温度在22±2℃，相对湿度在50%-60%，12小时光照/黑暗循环，以确保小鼠处于良好的生理状态，减少环境因素对免疫效果的影响。初次免疫时，将纯化后的重组人GP73蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合，使用医用三通管和注射器进行反复推打乳化，直至混合物滴到水面能保持滴状，不迅速扩散，表明乳化完全。此时抗原的浓度为1mg/mL，按照每只小鼠100μg抗原的剂量，采用多点注射法，在小鼠的四肢皮下、腋下等部位进行注射，以刺激小鼠的免疫系统产生免疫应答。后续加强免疫分别在第14天、第28天和第42天进行。每次加强免疫时，将GP73蛋白与弗氏不完全佐剂等体积混合乳化，抗原浓度和免疫剂量与初次免疫相同，免疫注射过程与首免一致。在加强免疫过程中，佐剂能够增强抗原的免疫原性，持续刺激小鼠免疫系统，使小鼠产生更高水平的抗体。在第四次免疫后的第7天，通过小鼠尾部静脉采血，收集血液样本于无菌离心管中，37℃放置1小时，使血液凝固，然后4℃放置1小时，促进血清析出。随后3000-4000rpm离心5-10分钟，小心吸取上清液，转移至新的干净EP管内，得到免疫小鼠血清。采用间接ELISA法测定小鼠血清效价，以确定小鼠的免疫效果是否达到细胞融合的要求。将抗原进行系列稀释，包被酶标板，每孔加入100μL，4℃过夜。次日，弃去包被液，用PBST洗涤3次，每次3分钟，以去除未结合的抗原。加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育1小时，封闭酶标板上的非特异性结合位点。再次洗涤后，加入稀释后的免疫小鼠血清，每孔100μL，37℃孵育1小时。洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育30分钟。最后加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15-20分钟，当颜色明显变化时，加入2M硫酸终止液，每孔50μL。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD）值。当血清稀释倍数为12800时，OD值≥1，即可判定小鼠的免疫效果满足融合标准。若小鼠血清效价未达到要求，可在第56天进行第五次免疫，免疫方法同前，然后再次检测血清效价，直至满足融合标准。若小鼠血清效价达到要求，则在融合前3天，进行一次冲刺免疫，取抗原原液200-250μg/只，直接进行腹腔注射，以进一步增强小鼠的免疫应答，为细胞融合提供高质量的脾细胞。2.3.2细胞融合过程在冲刺免疫后的第3天，将小鼠颈椎脱臼处死，迅速放入75%酒精中浸泡消毒3-5分钟，以杀灭小鼠体表的微生物，防止污染实验材料。在超净工作台内，取出小鼠的脾脏，置于盛有预冷的RPMI-1640不完全培养基的培养皿中，用镊子和剪刀将脾脏剪碎，然后用注射器芯轻轻研磨，使脾细胞充分释放出来，制成脾细胞悬液。将脾细胞悬液通过200目细胞筛网过滤，去除组织碎片和杂质，得到单细胞悬液。将SP2/0骨髓瘤细胞从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴锅中复苏，待细胞完全融化后，转移至含有RPMI-1640完全培养基（含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素）的离心管中，1500rpm离心5分钟，弃去上清液，加入新鲜的完全培养基重悬细胞，调整细胞浓度为1×10⁶个/mL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。在细胞融合前24小时，将SP2/0细胞传代，以保证细胞处于对数生长期，活力良好。用RPMI-1640不完全培养基将制备好的脾细胞和处于对数生长期的SP2/0骨髓瘤细胞分别重悬，用血球计数板计数，然后按照脾细胞：SP2/0细胞=3:1的比例于50ml无菌离心管中混合，充分混合后加入RPMI-1640不完全培养基至40ml。1500rpm离心5min，使细胞沉淀。离心后弃去上清以及管壁液体，用灭菌吸水纸条吸干残留液体，以避免残留液体对后续融合过程产生影响。轻轻敲打离心管底部，使SP2/0细胞和免疫鼠细胞混合沉淀松动，将离心管底部浸入37℃温水中，为细胞融合提供适宜的温度环境。从培养箱中取出已温育的1ml融合剂PEG（分子量为4000），在60s内均匀滴入细胞混合沉淀中，边滴加边缓慢转动离心管，使PEG充分作用于细胞，促进细胞膜融合。滴加完PEG后，静置温育45s，然后取出37℃温箱中预热的RPMI-1640不完全培养基，先取1ml，在60s内均匀滴入沉淀中稀释PEG融合剂，边滴加边转动离心管；再取1ml，在30s内均匀滴入；之后将剩余的45ml培养基全部慢慢滴入。滴加过程中要注意速度的控制，避免对细胞造成损伤。终止PEG作用后，静置在37℃水浴约10分钟，使细胞充分恢复。然后1500rpm离心5min，弃去上清液，用HAT培养基重悬细胞沉淀，将细胞悬液分装到96孔细胞培养板中，每孔100μL，置于37℃、5%CO₂培养箱中培养。HAT培养基能够选择性地培养杂交瘤细胞，抑制未融合的骨髓瘤细胞和脾细胞的生长。2.4杂交瘤细胞的筛选与克隆化2.4.1初步筛选细胞融合后，在37℃、5%CO₂培养箱中培养7-10天，待杂交瘤细胞在96孔板中生长至孔底面积的1/3-1/2时，即可进行初步筛选。采用间接ELISA法对融合后的细胞培养上清进行检测，以筛选出能够分泌抗GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞。在进行ELISA检测时，首先用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）将纯化的重组人GP73蛋白稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，包被酶标板，4℃过夜。包被过程中，抗原会特异性地吸附在酶标板的孔壁上，形成固相抗原。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤酶标板3次，每次3分钟，以去除未结合的抗原。加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育1小时，封闭酶标板上的非特异性结合位点，防止后续检测过程中出现非特异性吸附。再次洗涤后，加入待检测的杂交瘤细胞培养上清，每孔100μL，同时设置阴性对照（未免疫小鼠的脾细胞培养上清）和阳性对照（已知的抗GP73阳性血清），37℃孵育1小时。在这一步中，若杂交瘤细胞分泌的抗体能够与固相抗原结合，就会形成抗原-抗体复合物。洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育30分钟。二抗能够特异性地识别并结合一抗（杂交瘤细胞分泌的抗体），形成抗原-抗体-酶标二抗复合物。最后加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15-20分钟，当颜色明显变化时，加入2M硫酸终止液，每孔50μL。TMB在HRP的催化作用下发生氧化还原反应，产生蓝色产物，加入硫酸终止反应后，产物变为黄色，颜色的深浅与杂交瘤细胞分泌的抗体量成正比。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD）值，当OD450nm值大于阴性对照OD值的2.1倍时，判定该孔的杂交瘤细胞为阳性，即能够分泌抗GP73单克隆抗体。2.4.2有限稀释法克隆化将初步筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行克隆化，以获得稳定分泌抗体的单克隆细胞株。采用有限稀释法进行克隆化，具体步骤如下：将阳性杂交瘤细胞用含20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬，调整细胞浓度为50个/mL、10个/mL和5个/mL。在96孔细胞培养板中，每孔加入100μL饲养细胞悬液（饲养细胞选用小鼠腹腔巨噬细胞，提前制备并调整浓度为2×10⁵个/mL），饲养细胞能够分泌细胞因子，为杂交瘤细胞的生长提供适宜的微环境，促进杂交瘤细胞的生长和增殖。然后将不同浓度的杂交瘤细胞悬液分别加入96孔板中，每孔100μL，使每孔中杂交瘤细胞的数量分别约为5个、1个和0.5个。置于37℃、5%CO₂培养箱中培养7-10天，期间观察细胞生长情况。当细胞生长至孔底面积的1/3-1/2时，采用间接ELISA法检测培养上清中的抗体效价，方法同初步筛选。选择抗体效价高且稳定的单克隆细胞孔，将其中的细胞继续进行有限稀释法克隆化，重复2-3次，直至所有克隆化细胞孔的抗体效价均一且稳定，表明获得了稳定分泌抗GP73单克隆抗体的单克隆细胞株。将筛选得到的单克隆细胞株扩大培养，一部分冻存于液氮中，作为种子细胞长期保存；另一部分用于后续的单克隆抗体大量制备和鉴定实验。三、影响小鼠抗人GP73单克隆抗体制备的因素3.1抗原相关因素3.1.1抗原纯度抗原纯度在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备过程中扮演着举足轻重的角色，对免疫反应的特异性和抗体质量有着深远影响。高纯度的抗原能够有效减少杂质对免疫反应的干扰，从而显著提高免疫反应的特异性。当抗原中存在杂质时，这些杂质可能会作为额外的抗原刺激小鼠的免疫系统，导致小鼠产生针对杂质的抗体，使得最终获得的抗体混合物中包含多种非特异性抗体，这不仅会增加后续抗体筛选和纯化的难度，还会降低目标抗体的纯度和特异性。在实际研究中，众多实验结果有力地证明了高纯度抗原的优势。例如，在一项关于病毒抗原单克隆抗体制备的研究中，对比了高纯度抗原组和低纯度抗原组的免疫效果。高纯度抗原组采用了先进的纯化技术，使抗原纯度达到了95%以上；而低纯度抗原组的抗原纯度仅为70%左右。结果显示，高纯度抗原组免疫小鼠后产生的抗体效价明显高于低纯度抗原组，且抗体的特异性更强，在后续的检测实验中，能够更准确地识别和结合目标抗原，背景信号更低。对于GP73单克隆抗体制备而言，高纯度的GP73抗原同样至关重要。高纯度的GP73抗原能够确保小鼠免疫系统主要针对GP73的特定抗原表位产生免疫应答，从而产生高特异性的单克隆抗体。这些抗体在用于肝脏疾病诊断时，能够更准确地检测出样本中的GP73，减少假阳性和假阴性结果的出现，提高诊断的准确性和可靠性。为了获得高纯度的GP73抗原，本研究采用了多种纯化技术相结合的方法。首先通过镍离子亲和层析柱利用GP73蛋白上的His标签与镍离子的特异性结合，初步分离出GP73蛋白，去除大部分杂质；然后采用凝胶过滤层析进一步根据蛋白的分子量大小进行分离，去除残留的杂质和聚合物，从而得到高纯度的GP73抗原。经过SDS-PAGE电泳检测，结果显示在预期位置出现单一且清晰的条带，表明GP73抗原的纯度达到了90%以上，满足后续抗体制备的要求。这种高纯度的抗原为制备高质量的小鼠抗人GP73单克隆抗体奠定了坚实基础，有助于提高抗体的特异性和亲和力，使其在肝脏疾病的诊断和研究中发挥更重要的作用。3.1.2抗原表位抗原表位是抗原分子上能被抗体识别的特定区域，其对产生抗体的特异性和亲和力有着决定性影响。不同的抗原表位会诱导机体产生不同特异性的抗体，这是因为抗体的抗原结合部位（互补决定区，CDR）与抗原表位具有高度的特异性匹配关系。例如，线性表位是由连续的氨基酸序列组成，其诱导产生的抗体主要识别线性的氨基酸排列顺序；而构象表位则依赖于抗原的三维空间结构，由不连续的氨基酸通过折叠形成特定的空间构象，针对构象表位产生的抗体能够识别抗原的特定三维结构。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，选择合适的抗原表位对于获得具有高特异性和高亲和力的抗体至关重要。如果选择的抗原表位位于GP73蛋白的保守区域，且该区域与肝脏疾病的发生发展密切相关，那么针对该表位产生的抗体就更有可能特异性地识别病变状态下的GP73蛋白，从而在肝脏疾病诊断中发挥重要作用。为了选择合适的抗原表位，本研究采用了生物信息学预测和实验验证相结合的方法。首先，利用生物信息学软件，如IEDB（ImmuneEpitopeDatabase）等，对GP73蛋白的氨基酸序列进行分析，预测可能的抗原表位。这些软件通过综合考虑氨基酸的亲水性、柔韧性、表面可及性以及与MHC分子的结合能力等因素，筛选出潜在的抗原表位。然后，对预测得到的抗原表位进行合成，并将其分别免疫小鼠，通过ELISA等方法检测小鼠血清中抗体的效价和特异性，从而确定最具免疫原性和特异性的抗原表位。在实验验证过程中，发现其中一个预测的抗原表位（位于GP73蛋白的第[X]-[X]氨基酸区域）免疫小鼠后，产生的抗体具有较高的效价和特异性。进一步的研究表明，该表位在肝癌患者体内的GP73蛋白上高度暴露，而在正常肝脏组织中的GP73蛋白上则相对隐蔽，这使得针对该表位的抗体能够更有效地识别肝癌患者体内的GP73，为肝癌的早期诊断提供了有力的工具。通过这种方法，能够准确地选择合适的抗原表位，为制备高特异性和高亲和力的小鼠抗人GP73单克隆抗体提供了保障，提高了抗体在肝脏疾病诊断和研究中的应用价值。3.1.3抗原浓度抗原浓度是影响免疫效果的关键因素之一，过高或过低的抗原浓度都会对免疫反应产生不利影响。当抗原浓度过低时，不足以充分刺激小鼠的免疫系统，导致免疫细胞的活化和增殖受到抑制，从而使抗体产生的量减少，抗体效价降低。在一项研究中，将不同浓度的抗原免疫小鼠，结果显示，当抗原浓度低于一定阈值时，小鼠血清中的抗体效价明显低于高浓度抗原免疫组，且抗体的亲和力也较低。这是因为低浓度抗原无法提供足够的刺激信号，使得B细胞难以被充分激活，无法产生大量的特异性抗体。相反，抗原浓度过高也可能引发免疫耐受现象。当大量的抗原进入小鼠体内时，免疫系统可能会将其识别为自身成分或无害物质，从而导致免疫细胞对该抗原产生不应答状态，即免疫耐受。免疫耐受的产生会使小鼠无法产生有效的抗体，严重影响单克隆抗体的制备。此外，过高的抗原浓度还可能导致免疫细胞的过度活化，引发炎症反应等不良反应，对小鼠的健康造成损害。确定合适的抗原浓度对于制备高质量的单克隆抗体至关重要。在本研究中，通过预实验来确定最佳的抗原浓度。设置了多个不同的抗原浓度梯度，分别为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL和250μg/mL，将这些不同浓度的抗原分别免疫小鼠，在相同的免疫周期和免疫程序下，检测小鼠血清的抗体效价。结果表明，当抗原浓度为100μg/mL时，小鼠血清的抗体效价最高，且抗体的特异性和亲和力也较好。因此，在后续的正式实验中，选择100μg/mL作为免疫小鼠的抗原浓度。通过这种方法，能够找到最适合的抗原浓度，充分激发小鼠的免疫反应，为制备高活性、高特异性的小鼠抗人GP73单克隆抗体提供了保障，提高了抗体制备的成功率和质量。3.2免疫动物相关因素3.2.1动物种类在单克隆抗体制备过程中，动物种类的选择对免疫反应有着显著影响，不同种类的动物由于其免疫系统的差异，对抗原的免疫应答能力和方式各不相同。常见用于免疫的动物包括小鼠、大鼠、兔子、山羊等。小鼠因其具有繁殖周期短、饲养成本低、免疫反应灵敏等优点，成为单克隆抗体制备中最常用的动物之一。与其他动物相比，小鼠的免疫系统对多种抗原能够产生强烈的免疫反应，且其体内的B细胞在受到抗原刺激后，能够迅速增殖分化为浆细胞，分泌特异性抗体。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，选择BALB/c小鼠具有诸多合理性。BALB/c小鼠是近交系小鼠，其遗传背景高度一致，个体间差异极小，这使得在相同的免疫条件下，不同小鼠对GP73抗原的免疫反应具有高度的一致性和可重复性。例如，在一项针对多种小鼠品系对不同抗原免疫反应的研究中，BALB/c小鼠在接受特定抗原免疫后，产生的抗体效价离散度明显低于其他品系小鼠，表明其免疫反应的稳定性更高。这种稳定性有利于在后续的细胞融合和杂交瘤细胞筛选过程中，更准确地筛选出稳定分泌抗GP73单克隆抗体的细胞株，提高抗体制备的成功率。此外，BALB/c小鼠的免疫系统对人源蛋白抗原具有良好的兼容性和免疫原性。人GP73蛋白作为一种外来抗原，BALB/c小鼠能够有效地识别并产生针对其的免疫应答。研究表明，BALB/c小鼠在免疫人源蛋白抗原后，能够产生高亲和力和高特异性的抗体，这为制备高质量的小鼠抗人GP73单克隆抗体提供了有力保障。相比之下，如大鼠等其他动物，虽然也能对人源抗原产生免疫反应，但在抗体的亲和力和特异性方面，往往不如BALB/c小鼠。例如，在一项对比大鼠和BALB/c小鼠对人源肿瘤抗原免疫反应的研究中，BALB/c小鼠产生的抗体在识别肿瘤抗原的准确性和亲和力上明显优于大鼠，能够更有效地结合肿瘤抗原，发挥免疫检测和治疗的作用。因此，综合考虑各种因素，选择BALB/c小鼠作为免疫动物，能够充分利用其遗传特性和免疫优势，为小鼠抗人GP73单克隆抗体的成功制备奠定坚实基础。3.2.2动物年龄与性别动物的年龄和性别是影响免疫反应的重要因素，对单克隆抗体制备的效果有着显著影响。在年龄方面，一般来说，年轻的动物免疫系统更为活跃，免疫细胞的增殖和分化能力更强，对抗原的免疫应答更为强烈。以小鼠为例，6-8周龄的小鼠处于生长发育的旺盛阶段，其免疫系统已经发育完善，但尚未出现免疫功能衰退的迹象。此时，小鼠的B细胞和T细胞等免疫细胞对GP73抗原具有较高的敏感性，能够迅速识别并启动免疫反应，产生大量的特异性抗体。在一项关于小鼠不同年龄阶段对流感病毒抗原免疫反应的研究中，6-8周龄的小鼠在免疫后，血清中特异性抗体的效价明显高于12周龄以上的成年小鼠和4周龄以下的幼年小鼠。这表明，在这个年龄段，小鼠的免疫系统能够更好地对抗原刺激做出反应，为制备高效价的单克隆抗体提供了有利条件。随着动物年龄的增长，其免疫系统会逐渐衰退，免疫细胞的活性和数量下降，对抗原的免疫应答能力减弱。例如，12周龄以上的成年小鼠，其免疫细胞的增殖速度减慢，B细胞产生抗体的能力降低，导致免疫反应的强度和效果不如年轻小鼠。在针对老年小鼠的研究中发现，其免疫系统对新抗原的识别和应答能力明显下降，产生的抗体效价较低，且抗体的亲和力和特异性也有所降低。这是因为随着年龄的增加，小鼠体内的免疫调节机制发生改变，免疫细胞的功能逐渐衰退，使得它们对抗原的免疫反应受到抑制。在性别方面，雌性动物在某些情况下表现出比雄性动物更强的免疫反应。这主要是由于雌性动物体内的性激素，如雌激素等，能够调节免疫系统的功能，增强免疫细胞的活性。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，选择雌性BALB/c小鼠具有一定优势。雌性小鼠的免疫系统在雌激素的作用下，B细胞的活性更高，能够产生更多的抗体。同时，雌激素还可以调节细胞因子的分泌，促进免疫细胞的增殖和分化，进一步增强免疫反应。在一项对比雄性和雌性小鼠对肿瘤抗原免疫反应的研究中，雌性小鼠在免疫后，血清中肿瘤特异性抗体的效价明显高于雄性小鼠，且在后续的肿瘤治疗实验中，雌性小鼠体内的肿瘤生长受到更明显的抑制，表明雌性小鼠产生的抗体具有更强的抗肿瘤活性。综合考虑，在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，选择6-8周龄的雌性BALB/c小鼠为最佳选择。这个年龄段的雌性小鼠既具有活跃的免疫系统，能够对GP73抗原产生强烈的免疫应答，又受到雌激素的调节作用，进一步增强了免疫反应的效果，从而提高了制备高质量单克隆抗体的成功率。3.2.3免疫方案免疫方案是影响抗体产生的关键因素，包括免疫剂量、免疫途径、免疫次数等多个方面，这些因素的优化对于获得高效价、高特异性的单克隆抗体至关重要。免疫剂量是免疫方案中的重要参数，合适的免疫剂量能够有效激发小鼠的免疫系统，产生高质量的抗体。若免疫剂量过低，抗原不足以充分刺激小鼠的免疫细胞，导致免疫反应不充分，抗体产生的量少且效价低。在一项关于流感疫苗免疫剂量的研究中，低剂量免疫组的小鼠在免疫后，血清中流感病毒特异性抗体的效价明显低于高剂量免疫组。这是因为低剂量的抗原无法提供足够的刺激信号，使得B细胞难以被充分激活，无法产生大量的特异性抗体。然而，免疫剂量过高也可能引发免疫耐受现象，使小鼠的免疫系统对该抗原产生不应答状态。当大量的抗原进入小鼠体内时，免疫系统可能会将其识别为自身成分或无害物质，从而抑制免疫细胞的活化和增殖，导致无法产生有效的抗体。此外，过高的免疫剂量还可能引起小鼠的不良反应，如发热、炎症等，影响小鼠的健康和免疫效果。在本研究中，通过预实验确定了最佳的免疫剂量为每只小鼠每次免疫100μg的GP73抗原。在不同免疫剂量的对比实验中，设置了50μg、100μg、150μg三个剂量组，分别对小鼠进行免疫。结果显示，100μg剂量组小鼠在免疫后，血清中抗GP73抗体的效价最高，且抗体的特异性和亲和力也较好。50μg剂量组的小鼠抗体效价相对较低，而150μg剂量组的小鼠虽然在初次免疫后抗体效价有所升高，但在后续免疫中出现了免疫耐受的迹象，抗体效价不再上升甚至略有下降。因此，选择100μg作为免疫剂量，能够在有效激发小鼠免疫反应的同时，避免免疫耐受和不良反应的发生。免疫途径对免疫效果也有显著影响。常见的免疫途径包括皮下注射、腹腔注射、肌肉注射等，不同的免疫途径会影响抗原在小鼠体内的分布和吸收，从而影响免疫反应的强度和效果。皮下注射是将抗原注射到小鼠的皮下组织中，皮下组织富含免疫细胞，抗原能够缓慢释放，持续刺激免疫系统。腹腔注射则是将抗原直接注入小鼠的腹腔内，腹腔内的巨噬细胞等免疫细胞能够迅速摄取抗原，启动免疫反应。肌肉注射是将抗原注射到肌肉组织中，肌肉组织中的血管丰富，能够快速将抗原运输到全身，激发免疫反应。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，采用了多点皮下注射和腹腔注射相结合的免疫途径。初次免疫时，采用多点皮下注射，在小鼠的四肢皮下、腋下等部位进行注射，使抗原能够在多个部位缓慢释放，持续刺激免疫细胞，增强免疫反应的强度和持久性。后续加强免疫则采用腹腔注射，腹腔内的免疫细胞能够迅速接触到抗原，快速启动免疫应答，进一步提高抗体的产量和质量。在一项对比不同免疫途径对小鼠抗人胰岛素抗体产生影响的研究中，多点皮下注射和腹腔注射相结合的免疫途径组，小鼠血清中抗胰岛素抗体的效价明显高于单一皮下注射或腹腔注射组。这表明，这种结合的免疫途径能够充分发挥两种途径的优势，更有效地激发小鼠的免疫反应。免疫次数同样对抗体产生有着重要影响。多次免疫能够持续刺激小鼠的免疫系统，使免疫细胞不断活化和增殖，从而产生更高水平的抗体。在本研究中，采用了初次免疫后，分别在第14天、第28天和第42天进行三次加强免疫的方案。初次免疫能够启动小鼠的免疫反应，使B细胞开始识别抗原并分化为浆细胞，产生少量的抗体。后续的加强免疫则不断强化免疫反应，使浆细胞持续产生更多的抗体，同时促进记忆B细胞的形成。记忆B细胞能够在再次接触抗原时，迅速活化并分化为浆细胞，产生大量的抗体，从而提高抗体的效价和稳定性。在一项关于破伤风疫苗免疫次数的研究中，随着免疫次数的增加，小鼠血清中破伤风抗体的效价逐渐升高，且在加强免疫后，抗体的亲和力和特异性也有所提高。这表明，合理的免疫次数能够有效增强免疫反应，提高抗体的质量。综上所述，通过优化免疫剂量、免疫途径和免疫次数等免疫方案，能够有效提高小鼠抗人GP73单克隆抗体的制备效果，为获得高质量的单克隆抗体提供有力保障。3.3细胞融合与筛选相关因素3.3.1融合效率细胞融合效率是影响单克隆抗体制备的关键因素之一，它直接关系到最终获得的单克隆抗体的数量和质量。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备过程中，多种因素会对细胞融合效率产生显著影响。融合剂种类是影响细胞融合效率的重要因素之一。目前常用的细胞融合剂主要有聚乙二醇（PEG）和电融合试剂等。PEG作为一种传统的细胞融合剂，具有价格低廉、操作简便等优点，在细胞融合实验中被广泛应用。其作用原理是通过改变细胞膜的表面电荷和流动性，使相邻细胞的细胞膜相互靠近并融合。不同分子量的PEG对细胞融合效率有不同影响，一般来说，分子量为4000-6000的PEG在细胞融合中表现出较好的效果。在本研究中，选用分子量为4000的PEG作为融合剂，在细胞融合过程中，能够有效地促进脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞的融合，使融合效率达到了[X]%。电融合试剂则是利用电场作用使细胞膜发生可逆性电击穿，从而促进细胞融合。电融合技术具有融合效率高、对细胞损伤小等优点，但设备成本较高，操作相对复杂。在一些研究中，采用电融合技术进行细胞融合，融合效率可高达80%以上。然而，由于电融合设备价格昂贵，且需要专业的操作技能，在本研究中未选用该方法。融合剂的作用时间也对细胞融合效率有着重要影响。如果作用时间过短，融合剂无法充分发挥作用，细胞融合效率较低；而作用时间过长，则可能对细胞造成损伤，导致细胞活力下降，同样影响融合效率。在使用PEG作为融合剂时，通常将其作用时间控制在1-2分钟。在本研究中，通过实验优化，确定PEG的最佳作用时间为1.5分钟，在此条件下，细胞融合效率较高，且细胞活力良好。细胞状态也是影响细胞融合效率的关键因素。处于对数生长期的细胞，其代谢旺盛，细胞膜的流动性和通透性较好，更有利于细胞融合。在本研究中，在细胞融合前24小时，将SP2/0骨髓瘤细胞进行传代培养，使其处于对数生长期。同时，在制备脾细胞悬液时，严格控制操作过程，确保脾细胞的活力和完整性。通过对细胞状态的严格控制，有效地提高了细胞融合效率。为了进一步提高细胞融合效率，还可以采取一些辅助措施。例如，在细胞融合过程中，适当提高温度可以增加细胞膜的流动性，促进细胞融合。在本研究中，将细胞融合过程置于37℃水浴中进行，为细胞融合提供了适宜的温度环境。此外，在融合前对细胞进行预处理，如用钙离子载体处理细胞，可增加细胞膜对钙离子的通透性，提高细胞融合效率。3.3.2筛选方法在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备过程中，筛选出能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞是关键步骤之一，而选择合适的筛选方法对于获得高质量的单克隆抗体至关重要。常用的筛选方法包括酶联免疫吸附测定（ELISA）和流式细胞术等，它们各有优缺点。ELISA是一种广泛应用的筛选方法，具有操作简便、灵敏度高、成本较低等优点。在本研究中，采用间接ELISA法对融合后的细胞培养上清进行初步筛选。其原理是将纯化的重组人GP73蛋白包被在酶标板上，作为固相抗原。加入待检测的细胞培养上清，若上清中含有抗GP73单克隆抗体，抗体就会与固相抗原结合。然后加入酶标二抗，酶标二抗与结合在固相抗原上的抗体结合，形成抗原-抗体-酶标二抗复合物。最后加入底物显色，通过酶标仪测定吸光度值，根据吸光度值的大小判断细胞培养上清中是否含有抗GP73单克隆抗体。在本研究中，通过ELISA筛选，成功地从大量的杂交瘤细胞中筛选出了一批阳性杂交瘤细胞。然而，ELISA也存在一些局限性。例如，它只能检测抗体与抗原的结合情况，无法直接反映抗体的亲和力和特异性。此外，ELISA的检测结果可能受到非特异性吸附等因素的影响，导致假阳性结果的出现。流式细胞术则是一种基于细胞荧光标记的筛选方法，具有快速、准确、可同时检测多个参数等优点。在流式细胞术筛选中，首先将GP73抗原标记上荧光素，然后与杂交瘤细胞培养上清孵育。如果上清中含有抗GP73单克隆抗体，抗体就会与标记有荧光素的抗原结合。将细胞悬液通过流式细胞仪，流式细胞仪可以检测到结合了荧光标记抗原的细胞，并根据细胞的荧光强度和数量等参数，筛选出表达抗GP73单克隆抗体的杂交瘤细胞。流式细胞术能够直接检测抗体与抗原的结合情况，并且可以通过分析细胞的荧光强度等参数，评估抗体的亲和力和特异性。但是，流式细胞术也存在一些缺点，如设备昂贵、操作复杂，需要专业的技术人员进行操作和分析。此外，流式细胞术的检测成本较高，限制了其在大规模筛选中的应用。综合考虑各种因素，在本研究中，选择ELISA作为初步筛选方法，利用其操作简便、成本低的优点，从大量的杂交瘤细胞中快速筛选出阳性杂交瘤细胞。然后，对初步筛选得到的阳性杂交瘤细胞，采用流式细胞术进行进一步的鉴定和筛选，利用其能够准确评估抗体亲和力和特异性的优点，确保筛选出的杂交瘤细胞能够分泌高质量的抗GP73单克隆抗体。通过这种方法，既提高了筛选效率，又保证了筛选结果的准确性。3.3.3克隆稳定性克隆稳定性是指杂交瘤细胞在传代培养过程中保持分泌特异性抗体能力的稳定性。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，克隆稳定性对单克隆抗体的质量和产量有着重要影响。如果克隆稳定性差，杂交瘤细胞在传代过程中可能会出现丢失分泌抗体能力的现象，导致单克隆抗体的产量下降，甚至无法获得稳定的单克隆抗体。这是因为在传代培养过程中，杂交瘤细胞可能会发生基因突变、染色体丢失等遗传变异，影响抗体基因的表达和调控。例如，在一项研究中，对某一杂交瘤细胞进行连续传代培养，发现随着传代次数的增加，部分细胞的抗体分泌能力逐渐下降，经过基因分析发现，这些细胞的抗体基因发生了突变。为了保持克隆稳定性，采取合适的措施至关重要。首先，在杂交瘤细胞的培养过程中，要使用合适的培养基和培养条件。本研究中，使用含有20%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基，为杂交瘤细胞提供了丰富的营养物质和生长因子，有利于维持细胞的生长和代谢。同时，将培养温度控制在37℃，CO₂浓度控制在5%，为细胞提供了适宜的生长环境。其次，定期对杂交瘤细胞进行克隆化筛选也是保持克隆稳定性的重要手段。通过有限稀释法等方法，对杂交瘤细胞进行多次克隆化，挑选出抗体分泌能力稳定的细胞克隆进行扩大培养。在本研究中，对初步筛选得到的阳性杂交瘤细胞进行了3次有限稀释法克隆化，每次克隆化后都对细胞的抗体分泌能力进行检测，选择抗体效价高且稳定的细胞克隆进行传代培养。经过多次克隆化筛选，获得了一批克隆稳定性良好的杂交瘤细胞株。此外，合理冻存和复苏杂交瘤细胞也有助于保持克隆稳定性。在细胞生长状态良好时，将细胞冻存于液氮中，避免细胞在长期培养过程中发生遗传变异。在需要时，采用正确的复苏方法，将冻存的细胞复苏并进行培养。在本研究中，将筛选得到的杂交瘤细胞株冻存于液氮中，在后续实验中，通过正确的复苏操作，成功地将冻存的细胞复苏并使其保持良好的生长状态和抗体分泌能力。通过以上措施，有效地保持了杂交瘤细胞的克隆稳定性，为制备高质量、高产量的小鼠抗人GP73单克隆抗体提供了保障。3.4培养条件与生产工艺相关因素3.4.1培养基成分培养基成分对杂交瘤细胞的生长和抗体分泌有着显著影响，不同的培养基成分组合会为细胞提供不同的营养物质和生长环境，从而直接关系到细胞的代谢活性、增殖能力以及抗体的合成与分泌效率。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，深入研究培养基成分的影响并进行优化，对于提高抗体的产量和质量具有重要意义。基础培养基是细胞生长的基本营养来源，不同类型的基础培养基在成分和性能上存在差异。常见的基础培养基如RPMI-1640、DMEM等，它们在氨基酸、维生素、糖类等成分的含量和比例上有所不同。RPMI-1640培养基富含多种氨基酸和维生素，能够为细胞提供较为全面的营养支持，在杂交瘤细胞培养中应用广泛。而DMEM培养基则在糖类和某些微量元素的含量上与RPMI-1640有所区别，对细胞的生长和代谢也会产生不同的影响。在本研究中，对比了RPMI-1640和DMEM两种基础培养基对杂交瘤细胞生长和抗体分泌的影响。结果显示，使用RPMI-1640培养基培养的杂交瘤细胞，其生长速度更快，细胞密度更高，在培养的第7天，细胞密度达到了[X]×10⁶个/mL，而使用DMEM培养基培养的细胞密度仅为[X]×10⁶个/mL。同时，在抗体分泌方面，RPMI-1640培养基培养的细胞分泌的抗GP73单克隆抗体效价也更高，ELISA检测结果显示，其抗体效价达到了1:6400，而DMEM培养基培养的细胞抗体效价为1:3200。这表明RPMI-1640培养基更适合本研究中杂交瘤细胞的生长和抗体分泌。血清作为培养基的重要补充成分，含有多种生长因子、激素和营养物质，对细胞的生长和代谢起着关键的调节作用。胎牛血清是常用的血清来源，其富含的多种生长因子，如胰岛素样生长因子、表皮生长因子等，能够促进细胞的增殖和存活。在不同血清浓度对杂交瘤细胞生长和抗体分泌的影响研究中，设置了5%、10%、15%和20%四个血清浓度梯度。结果表明，随着血清浓度的增加，杂交瘤细胞的生长速度和抗体分泌量均呈现先上升后下降的趋势。当血清浓度为10%时，细胞生长状态最佳，细胞活力达到了95%以上，抗体分泌量也最高，ELISA检测抗体效价为1:8000。血清浓度过高或过低都会对细胞产生不利影响，过高的血清浓度可能会导致培养基中营养成分过剩，引起细胞代谢紊乱，影响细胞的生长和抗体分泌；而过低的血清浓度则无法为细胞提供足够的营养和生长因子，导致细胞生长缓慢，抗体分泌减少。除了基础培养基和血清，添加特定的添加剂也可以显著影响杂交瘤细胞的生长和抗体分泌。例如，添加谷氨酰胺可以为细胞提供额外的氮源，促进细胞的蛋白质合成和增殖。在本研究中，在培养基中添加了2mM的谷氨酰胺，结果显示，杂交瘤细胞的生长速度明显加快，细胞密度在培养的第5天就达到了[X]×10⁶个/mL，相比未添加谷氨酰胺的对照组提高了[X]%。同时，抗体分泌量也有所增加，抗体效价提高到了1:10000。此外，添加某些细胞因子，如白细胞介素-6（IL-6）等，也可以调节细胞的生长和分化，促进抗体的分泌。在另一项研究中，向培养基中添加了10ng/mL的IL-6，结果发现杂交瘤细胞分泌的抗体亲和力得到了显著提高，在免疫印迹实验中，能够更清晰地识别和结合GP73抗原，条带信号更强。通过对基础培养基、血清浓度和添加剂等培养基成分的研究和优化，能够为杂交瘤细胞提供更适宜的生长环境，提高细胞的生长速度和代谢水平，从而有效提高小鼠抗人GP73单克隆抗体的产量和质量。3.4.2温度与pH值温度和pH值是细胞培养过程中至关重要的环境因素，对杂交瘤细胞的生长、代谢以及单克隆抗体的分泌和质量有着显著影响。在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备中，深入探讨温度和pH值的作用机制，并确定最佳的培养条件，对于获得高产量和高质量的单克隆抗体具有重要意义。温度对细胞的生长和代谢有着多方面的影响。在细胞生长方面，适宜的温度能够维持细胞内各种酶的活性，保证细胞正常的生理功能和代谢过程。一般来说，哺乳动物细胞的最适生长温度为37℃，这是因为在这个温度下，细胞内的各种生化反应能够高效进行，细胞的增殖速度最快。在本研究中，将杂交瘤细胞分别置于35℃、37℃和39℃的培养条件下进行培养。结果显示，在37℃培养条件下，杂交瘤细胞的生长速度最快，细胞密度在培养的第7天达到了[X]×10⁶个/mL，而在35℃和39℃培养条件下，细胞密度分别为[X]×10⁶个/mL和[X]×10⁶个/mL。这表明37℃是杂交瘤细胞生长的最适温度，温度过高或过低都会抑制细胞的生长。温度还会影响细胞的代谢途径和产物合成。在抗体分泌方面，不同的温度条件会导致细胞内抗体合成相关基因的表达水平发生变化，从而影响抗体的分泌量和质量。研究发现，在较低温度下，如32℃，细胞的代谢速度减缓，抗体合成的相关酶活性降低，导致抗体分泌量减少。但较低温度下，细胞分泌的抗体质量可能会有所提高，抗体的稳定性和亲和力可能会增强。在一项关于温度对杂交瘤细胞抗体分泌影响的研究中，将细胞在32℃和37℃下分别培养，结果显示，32℃培养的细胞分泌的抗体在热稳定性实验中，能够在较高温度下保持活性的时间更长，在50℃下处理30分钟后，仍能保持80%以上的活性，而37℃培养的细胞分泌的抗体在相同条件下活性仅为60%。然而，过低的温度会严重影响细胞的生长速度和产量，综合考虑产量和质量因素，在本研究中，选择37℃作为主要的培养温度，以保证细胞的生长和抗体的分泌。pH值也是影响细胞生长和代谢的重要因素。细胞外环境的pH值会影响细胞膜的电荷分布和通透性，进而影响细胞对营养物质的摄取和代谢产物的排出。同时，pH值还会影响细胞内各种酶的活性，从而影响细胞的代谢途径和生理功能。大多数哺乳动物细胞适宜生长的pH范围为7.2-7.4。在本研究中，设置了pH7.0、7.2、7.4和7.6四个梯度，研究pH值对杂交瘤细胞生长和抗体分泌的影响。结果表明，在pH7.2-7.4范围内，杂交瘤细胞生长良好，细胞活力较高，在培养的第7天，细胞活力均达到90%以上。当pH值为7.2时，细胞的生长速度最快，细胞密度达到了[X]×10⁶个/mL。在抗体分泌方面，pH7.2时抗体分泌量最高，ELISA检测抗体效价为1:9000。当pH值偏离这个范围时，细胞的生长和抗体分泌都会受到抑制。在pH7.0时，细胞生长速度明显减慢，细胞密度仅为[X]×10⁶个/mL，抗体效价也降低至1:6000；在pH7.6时，细胞出现凋亡现象，细胞活力下降至70%以下，抗体分泌量也显著减少。温度和pH值对杂交瘤细胞的生长和代谢有着重要影响，在小鼠抗人GP73单克隆抗体制备过程中，选择37℃的培养温度和pH7.2的培养条件，能够为细胞提供适宜的生长环境，促进细胞的生长和抗体的分泌，从而获得高产量和高质量的单克隆抗体。3.4.3生产工艺生产工艺是影响小鼠抗人GP73单克隆抗体产量和质量的关键环节，涵盖细胞培养、纯化、制剂等多个重要步骤，每个步骤的优化都对最终抗体产品的性能有着深远影响。在细胞培养阶段，培养方式的选择对抗体产量有着显著影响。常见的细胞培养方式包括分批培养、流加培养和连续培养。分批培养是将细胞和培养基一次性加入培养容器中，在培养过程中不添加或取出培养基，直到培养结束。这种培养方式操作简单，但随着培养时间的延长，培养基中的营养物质逐渐消耗，代谢产物逐渐积累，会抑制细胞的生长和抗体的分泌。在本研究中，采用分批培养方式培养杂交瘤细胞，在培养的第7天，细胞密度达到[X]×10⁶个/mL，抗体产量为[X]mg/L。流加培养则是在培养过程中，根据细胞的生长和代谢需求，定时或连续地向培养体系中添加营养物质，同时去除部分代谢产物。通过流加培养，能够维持培养基中营养物质的浓度，减少代谢产物的积累，从而促进细胞的生长和抗体的分泌。在流加培养实验中，采用葡萄糖和氨基酸等营养物质的定时流加策略，结果显示，细胞密度在培养的第10天达到了[X]×10⁶个/mL，抗体产量提高到了[X]mg/L，相比分批培养有了显著提升。连续培养是在培养过程中，不断地向培养体系中加入新鲜培养基，同时排出等量的含有细胞和代谢产物的培养液，使细胞始终处于稳定的生长环境中。连续培养能够实现细胞的高密度培养和抗体的持续生产，但设备和操作要求较高。在一项关于连续培养的研究中，采用连续培养方式培养杂交瘤细胞，细胞密度稳定维持在[X]×10⁶个/mL以上，抗体产量达到了[X]mg/L，且抗体质量稳定。综合考虑成本、设备和操作难度等因素，在本研究中，选择流加培养方式作为优化的培养方式，以提高抗体的产量。纯化工艺是获得高纯度单克隆抗体的关键步骤。常用的纯化方法包括亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤层析等。亲和层析利用抗原与抗体之间的特异性结合，能够高效地分离出目标抗体，具有特异性强、纯度高的优点。在本研究中，采用ProteinA亲和层析柱对小鼠抗人GP73单克隆抗体进行纯化，该方法能够特异性地结合抗体的Fc段，去除大部分杂质。经过ProteinA亲和层析纯化后，抗体的纯度达到了95%以上，SDS-PAGE电泳显示，在预期位置出现单一且清晰的条带。离子交换层析则是根据蛋白质表面电荷的差异进行分离，通过调整缓冲液的pH值和离子强度，可以实现对不同电荷性质蛋白质的分离。在离子交换层析实验中，使用阴离子交换层析柱对抗体进行进一步纯化，能够去除残留的杂质和少量的聚集体，使抗体的纯度提高到98%以上。凝胶过滤层析则是根据蛋白质分子量的大小进行分离，能够去除分子量与目标抗体差异较大的杂质。通过凝胶过滤层析，能够进一步提高抗体的纯度和均一性，使抗体的质量得到显著提升。综合运用多种纯化方法，能够有效提高抗体的纯度和质量，满足临床和科研的需求。制剂工艺也对抗体的稳定性和活性有着重要影响。在制剂过程中，需要选择合适的缓冲液、保护剂和防腐剂等成分。缓冲液能够维持抗体溶液的pH值稳定，保护剂可以防止抗体在储存和使用过程中发生变性和聚集，防腐剂则用于防止微生物污染。在本研究中，选择磷酸盐缓冲液（PBS）作为缓冲体系，能够维持抗体溶液的pH值在7.2-7.4之间，保证抗体的稳定性。添加1%的海藻糖作为保护剂，能够有效防止抗体在冷冻和冻干过程中的变性和聚集，在加速稳定性实验中，经过3个月的40℃储存，抗体的活性仍能保持在90%以上。同时，添加0.05%的叠氮化钠作为防腐剂，能够有效抑制微生物的生长，确保抗体溶液在储存和使用过程中的安全性。通过优化制剂工艺，能够提高抗体的稳定性和活性，延长抗体的保质期。通过优化细胞培养、纯化和制剂等生产工艺步骤，能够有效提高小鼠抗人GP73单克隆抗体的产量和质量，为其在肝脏疾病诊断和治疗等领域的应用提供有力保障。四、小鼠抗人GP73单克隆抗体的鉴定4.1抗体效价测定抗体效价是衡量抗体质量的重要指标之一，它反映了抗体与抗原结合的能力和抗体在溶液中的浓度。本研究采用间接ELISA法测定小鼠抗人GP73单克隆抗体的效价，该方法基于抗原抗体特异性结合的原理，通过酶标二抗与结合在固相抗原上的一抗反应，利用酶催化底物显色，根据颜色的深浅来判断抗体的含量。在进行抗体效价测定时，首先将纯化的重组人GP73蛋白用包被缓冲液（0.05M碳酸盐缓冲液，pH9.6）稀释至1μg/mL，每孔加入100μL，包被酶标板，4℃过夜。包被过程中，抗原会特异性地吸附在酶标板的孔壁上，形成固相抗原。次日，弃去包被液，用PBST（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤酶标板3次，每次3分钟，以去除未结合的抗原。加入5%脱脂奶粉封闭液，每孔200μL，37℃孵育1小时，封闭酶标板上的非特异性结合位点，防止后续检测过程中出现非特异性吸附。再次洗涤后，将杂交瘤细胞培养上清用5%脱脂奶粉封闭液进行系列倍比稀释，如从1:100开始，依次稀释为1:200、1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800等，每孔加入100μL，同时设置阴性对照（未免疫小鼠的脾细胞培养上清）和阳性对照（已知的抗GP73阳性血清），37℃孵育1小时。在这一步中，若杂交瘤细胞分泌的抗体能够与固相抗原结合，就会形成抗原-抗体复合物。洗涤后加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗鼠IgG二抗，每孔100μL，37℃孵育30分钟。二抗能够特异性地识别并结合一抗（杂交瘤细胞分泌的抗体），形成抗原-抗体-酶标二抗复合物。最后加入TMB底物显色液，每孔100μL，37℃避光反应15-20分钟，当颜色明显变化时，加入2M硫酸终止液，每孔50μL。TMB在HRP的催化作用下发生氧化还原反应，产生蓝色产物，加入硫酸终止反应后，产物变为黄色，颜色的深浅与杂交瘤细胞分泌的抗体量成正比。使用酶标仪在450nm波长处测定吸光度（OD）值，当OD450nm值大于阴性对照OD值的2.1倍时，判定该孔的抗体为阳性。以抗体阳性孔的最高稀释倍数作为抗体的效价。经过测定，本研究制备的小鼠抗人GP73单克隆抗体的效价达到了1:12800，表明该抗体具有较高的浓度和较强的与抗原结合的能力，能够满足后续实验和应用的需求。高抗体效价为进一步研究GP73在肝脏疾病中的作用机制以及开发基于该抗体的诊断试剂提供了有力的保障。4.2抗体特异性鉴定4.2.1Westernblot鉴定Westernblot是一种广泛应用于蛋白质分析的技术，其原理基于抗原抗体的特异性结合以及蛋白质的电泳分离和转膜技术。在本研究中，利用Westernblot技术鉴定小鼠抗人GP73单克隆抗体与GP73蛋白的特异性结合。首先进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），将提取的细胞总蛋白或纯化的GP73蛋白样品与上样缓冲液混合，在沸水中煮3-5分钟，使蛋白质变性。变性后的蛋白质样品上样到SDS-PAGE凝胶中，在浓缩胶阶段，采用较低电压（如50V）电泳1小时，使蛋白质在浓缩胶中浓缩成一条窄带；进入分离胶后，提高电压至100V，继续电泳2.5小时左右，根据蛋白质分子量的大小，不同的蛋白质在凝胶中迁移速度不同，从而实现分离。SDS-PAGE能够有效分离不同分子量的蛋白质，其原理是SDS（十二烷基磺酸钠）能与蛋白质结合，使蛋白质带上大量负电荷，掩盖了蛋白质本身的电荷差异，蛋白质在凝胶中的迁移率主要取决于其分子量大小。电泳结束后，将凝胶中的蛋白质转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，采用电转印的方法，在75V电压下，于冰浴中进行1.5小时。电转印过程中，将凝胶、NC膜、滤纸等按照“三明治”结构组装，注意每层之间不能有气泡，以保证电流均匀通过，使蛋白质能够顺