KTA2010-CN-一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）

一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）Cat#:KTA2010 Size：50T/100T 一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光） 货号：KTA2010 批号：见产品标签 应用实验：适用细胞及组织样本的流式细胞术、荧光检测等实验 保质期：-20℃，避光保存6个月原理细胞凋亡中,染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧尿苷三磷酸核苷酸（dUTP）和荧光素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal-deoxynucleotidyltransferasemediatednickendlabeling,TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（绿色荧光）提供实验所需的全套试剂组分以及优化的实验方案，适用于荧光酶标仪、荧光显微镜、流式细胞仪。适用于如下样品类型：贴壁细胞，悬浮细胞，石蜡包埋组织切片，冰冻切片。荧光信号检测通道为FITC通道（Ex/Em=490nm/520nm）。包装清单试剂盒组分 规格 储存条件 50T 100T TdTEnzyme 100µL 200µL -20℃EquilibrationBuffer(5×) 1mL 2mL -20℃LabelMixGreen 17µL 35µL -20℃，避光保存ProbeDiluent 0.5mL 1mL 4℃DAPI(500×) 12µL 24µL -20℃，避光保存BSAWorkingSolution 15mL 30mL -20℃TritonX-100(100%) 100µL 100µL 4℃DNaseI(5U/µL) 10µL 10µL -20℃10×DNaseIBuffer 0.6mL 0.6mL -20℃ProteinaseK(20mg/mL) 10µL 20µL -20℃自备耗材·离心机，荧光显微镜·96孔细胞板，可调节式移液枪及枪头，10mMTrispH7.5，磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4）·4%多聚甲醛，去离子水，组织自发荧光淬灭剂试剂准备WorkingLabelMixGreen：根据实际用量，用ProbeDiluent将LabelMixGreen稀释15倍得到WorkingLabelMixGreen，未用完的WorkingLabelMixGreen于-20℃避光分装保存3个月，避免反复冻融。DAPI(1×)：根据实际用量，用PBS将DAPI(500×)稀释成DAPI(1×)。TritonX-100(0.3%)：根据实际用量，用PBS将100%TritonX-100稀释成0.3%TritonX-100。1×EquilibrationBuffer：流式细胞仪分析需制备1×EquilibrationBuffer，根据实际用量，用去离子水将5×EquilibrationBuffer稀释成1×EquilibrationBuffer。1×DNaseIBuffer：根据实际用量，用去离子水将10×DNaseIBuffer稀释成1×DNaseIBuffer。实验步骤A.样本制备1.对于贴壁细胞（通过荧光显微镜分析）(1)在96孔板进行细胞培养，至少24h。通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照组细胞。(2)除去培养基，在室温下用50µL4%多聚甲醛固定细胞30min。(3)除去固定液并用200µLPBS浸洗3次，每次5min。(4)固定后，每孔添加50µL0.3%TritonX-100，并在室温下孵育30min。(5)除去通透剂，用50µLBSAWorkingSolution洗涤细胞2-3次。进行荧光显微镜分析（继续进行步骤B.1）。注意：对于细胞爬片及其他孔板细胞，可依据实际情况调整固定液和通透剂体积。2.对于非贴壁细胞（通过流式细胞仪分析）(1)培养细胞至最佳密度（约1-2×106细胞/mL），通过所需方法诱导细胞凋亡，同时培养无诱导的对照培养物。(2)以300g离心并收集细胞（1-5×106），用PBS洗涤2次。(3)加入1mL4%多聚甲醛，在室温下孵育30min。(4)以300g离心细胞，除去上清液，重悬于1mLPBS中，重复洗涤2次。(5)以300g离心细胞，除去上清液，在室温下，用500µL0.3%Triton-X100重悬细胞5min使其通透（或者将细胞在100µg/mL蛋白酶K的PBS中重悬5min使其通透）。(6)以300g离心细胞，除去上清液，重悬于1mLPBS中。重复洗涤2次，然后进行流式细胞仪分析（继续进行步骤B.2）。3.对于石蜡包埋的组织切片（通过荧光显微镜分析）(1)将组织在二甲苯浸泡2次，每次10-20min进行脱蜡。(2)通过以下步骤（按给定顺序）为组织复性：在100%乙醇中2次洗涤5min，然后依次在95%，70%和50%乙醇中洗涤3min。(3)用适量的PBS浸洗样品2次，每次5min。(4)排出组织中多余的PBS，并在20µg/mL蛋白酶K（在10mMTrispH7.5中，现配现用）溶液中室温孵育15min。注意：必须针对特定组织类型和厚度优化蛋白酶消化时间。蛋白酶过度消化将导致细胞结构丧失，组织切片可能会从玻片上脱落。消化不充分会导致TdT标记不彻底。(5)用适量的PBS浸洗样品3次，每次5min来终止蛋白酶消化作用，进行荧光显微镜分析（继续进行步骤B.1）。4.对于冰冻组织切片（通过荧光显微镜分析）(1)将切片在玻片上干燥后，在室温下用200µL4%多聚甲醛固定30min。(2)用适量的PBS浸洗2次，每次5min。(3)去除组织中多余的PBS，并在20µg/mL蛋白酶K（在10mMTrispH7.5中，现配现用）溶液中室温孵育15min。(4)用适量的PBS浸洗样品3次，每次5min来终止蛋白酶消化作用，进行荧光显微镜分析（继续进行步骤B.1）。注意：1.组织切片会产生自发荧光，可使用组织自发荧光淬灭剂进行处理。2.阳性对照的设置（可选），A步骤完成后，在室温条件下可用10U/mL的DNaseI（用1×DNaseIBuffer将5U/µL的DNaseI稀释成10U/mL）消化细胞或组织10-20min，然后再进行荧光显微镜分析。B.TUNEL分析1.荧光显微镜分析(1)根据要分析的样品数量，在使用前准备TdT标记反应缓冲液：反应组分 每孔体积（µL）TdTEnzyme 2EquilibrationBuffer(5×) 10WorkingLabelMixGreen 5去离子水 33总体积 50注意：配制TdT标记反应缓冲液之前，将各组分平衡至室温，EquilibrationBuffer(5×)母液因低温保存，会出现少量成分析出的现象，请颠倒混匀后使用。EquilibrationBuffer(5×)中含有高毒性化学物质二甲胂酸钠和氯化钴，皮肤接触后，立即用大量水冲洗。万一发生事故或感到不适，请立即就医。使用时请勿饮酒，饮食或吸烟。(2)向每个样品中加入50µL（96孔板推荐50µL，24孔板推荐200µL，切片建议添加100-200µL盖住组织即可）反应混合物，并在湿盒中37℃下避光孵育2h(不同的样本，可视情况调整孵育时间)。(3)用PBS将样品浸洗3次，每次5min。(4)用1×DAPI孵育10min对样品进行复染。注意：如需计算凋亡细胞比例，建议复染，根据染色组织的不同，复染浓度可能需要调整。DAPI过度染色可能导致难以观察荧光素标记。(5)用适量的PBS浸洗样品3次，每次5min。(6)对于细胞爬片、石蜡切片和冰冻切片等样本，可加入水性封固剂或抗荧光淬灭剂，封住盖玻片，用荧光显微镜进行观察。对于孔板、培养皿内细胞样本，加入适量PBS浸没细胞，再进行荧光显微镜拍照观察。FITC通道（Ex/Em=490nm/520nm）。显微镜拍照技巧：1）使用DAPI通道查找细胞位置；2）阴性对照组优先拍照，阴性对照显示荧光为非特异性染色荧光，需要通过黑白平衡进行扣除至无荧光；3）实验组或阳性组拍照，扣除与对照相同的黑白平衡，得到实验组或阳性组有效荧光。2.流式细胞仪分析(1)将细胞重悬于100µL1×EquilibrationBuffer中，在室温下避光孵育10min。(2)300g离心细胞，除去上清液，重悬于50µLTdT标记反应缓冲液中，在37℃下孵育2h(不同的样本，可视情况调整孵育时间)，孵育期间可定时轻轻地晃动以混匀细胞。(3)300g离心细胞。除去上清液，重悬于1mLPBS中。重复洗涤2次。(4)重悬于200µL1×DAPI中，孵育10min。(5)通过流式细胞仪分析细胞。草莓时刻：除了基于细胞核变化检测细胞凋亡，细胞质和线粒体的变化也能反映细胞凋亡情况。细胞质的变化包括Caspase（KTA3020，KTA3022）、Bax（ABM0074）的表达差异；线粒体膜电位下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件（KTA4001）。扫描右侧二维码，关注Abbkine公众号，了解更多Abbkine产品信息。 FAQ1.做TUNEL凋亡检测，需要抗原修复或者冰冻修复吗？需要先固定细胞，不需要做抗原修复，本试剂盒标记的是细胞核内的断裂基因，而不是抗原蛋白。2.TUNEL检测可以和免疫荧光（IF）一起双染吗？先后顺序在怎样的？可以和IF进行共染，建议先做TUNEL检