DB23T 3897-2024基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程

ICS65.020.01CCSB0523IDB23/T3897—2024本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由黑龙江省农业农村厅提出。本文件起草单位：东北农业大学、黑龙江省绿色食品科学研究院、哈尔滨学院、黑龙江省农业科学本文件主要起草人：胡小梅、李凤兰、董士嘉、李孝忠、王浩、谷春涛、高爱丽、孙以新、冯旭、高云飞、虞琦、贺付蒙、田苗。1DB23/T3897—2024基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术规程本标准界定了基于60Coγ辐射技术创制秸秆降解真菌种质资源筛选鉴定技术的术语和定义，规定了秸秆降解真菌创制、突变菌株筛选鉴定、秸秆降解菌株保藏和档案管理。本文件适用于60Coγ辐射诱变创制秸秆降解真菌种质资源的筛选与鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB10252γ辐照装置的辐射防护与安全规范GB/T17568γ辐照装置设计建造和使用规范GB/T23874饲料添加剂木聚糖酶活力的测定分光光度法HJ710.11-2014生物多样性观测技术导则大型真菌NY/T3494农业生物质原料纤维素、半纤维素、木质素测定SN/T2632微生物菌种常规保藏技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1秸秆降解真菌能够将作物秸秆分解、腐化的一类产孢丝状真菌。4秸秆降解真菌创制4.1菌种来源从自然环境中分离的具有降解秸秆能力的真菌，置于-80℃冰箱冻存备用。4.2培养方法4.2.1培养基4.2.1.1马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）培养基马铃薯浸出粉12g，葡萄糖20g，琼脂15g，去离子水定容至1000mL，121℃灭菌20min。4.2.1.2高粱粒培养基高粱粒5g，去离子水5mL，121℃灭菌20min。2DB23/T3897—20244.2.1.3产酶培养基（MA）十二水磷酸氢二钠17.907g，硫酸铵1.4g，磷酸二氢钾2.0g，七水硫酸镁0.60g，氯化钙0.60g，尿素0.3g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.5mL，蛋白胨2.0g，微量元素溶液1mL，pH5.5，去离子水定容至1000mL。4.2.1.4微量元素溶液七水硫酸亚铁0.5g，一水硫酸锰0.16g，七水硫酸锌0.14g，六水合二氯化钴0.2g，去离子水定容至100mL，0.22μm无菌滤膜过滤除菌。4.2.2菌种活化将冻存的菌种解冻后在PDA培养基上采用四区划线方法进行活化，长出单菌落后，备用。4.2.3孢子悬浮液制备将菌种活化后长出的单菌落接种至高粱粒培养基中，30℃培养，菌丝长满平板48h后，将产生的孢子用无菌0.9%（w/v）生理盐水洗脱并用四层无菌纱布过滤除去菌丝体，在6000rpm条件下离心20min收集沉淀。将沉淀再用适量生理盐水重悬后，利用血球计数板计算孢子浓度，并用生理盐水将孢子浓度稀释至1×106CFU/mL～1×108CFU/mL。4.3辐射处理4.3.1辐射剂量选择金属元素钴源（60Co）的γ射线进行辐射诱变处理，真菌孢子悬浮液的60Coγ辐射剂量以2000Gy为宜。4.3.2辐射装置60Coγ辐射装置应符合GB/T17568的规定。4.3.3辐射方法辐射方法应符合GB10252的规定。5突变菌株筛选鉴定5.1菌株筛选5.1.1筛选指标筛选指标包括菌株致死率、形态指标、纤维素酶和半纤维素酶活力、木质素酶活力、和秸秆降解率。5.1.2致死率诱变结果以致死率表示，致死率按式（1）计算：3DB23/T3897—2024式中：LR—致死率；Cc—阴性对照PDA平板菌落数；CT—试验组PDA平板菌落数。5.1.3形态指标筛选将辐射诱变后符合致死率≥85%的菌株孢子悬浮液稀释100倍，取100μL稀释孢子液涂布在PDA平板上。在28℃下培养至长出菌落，进行形态学观察，并与诱变前的菌株进行比较，获得形态上具有差异的突变菌株。5.1.4纤维素酶和半纤维素酶活力测定5.1.4.1内切葡聚糖酶活力取1%（w/v）羧甲基纤维素钠（CMC-Na）溶液1.5mL，加入0.5mL稀释后的粗酶液，50℃水浴条件下孵育30min。采用3,5-二硝基水杨酸（DNS）测定法，加入1.5mLDNS显色剂。沸水浴5min终止反应，在540nm波长处测定吸光度，三次重复实验。根据葡萄糖标准曲线计算酶活力，每分钟水解CMC-Na产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1U。对照组中加入沸水浴30min灭活的粗酶液，其它条件均相同，按照式（2）计算酶活力。5.1.4.2外切葡聚糖酶活力取0.1%（w/v）对硝基苯酚纤维二糖苷（pNPC）溶液50μL，加入100μL稀释后的粗酶液，50℃水浴条件下孵育30min。加入150μL10%Na2CO3溶液终止反应，在420nm波长下测定吸光度，三次重复实验。根据对硝基苯酚标准曲线计算酶活力，每分钟水解pNPC产生1μmol对硝基苯酚所需的酶量定义为1U。对照组中加入沸水浴30min灭活的粗酶液，其它条件均相同，按照式（2）计算酶活力。5.1.4.3β-葡萄糖苷酶活力取0.5%（w/v）水杨苷溶液，加入0.5mL稀释后的粗酶液，在50℃水浴条件下孵育30min。采用DNS测定法，加入1.5mLDNS显色剂，沸水浴5min终止反应，在540nm波长处测定吸光度，三次重复实验。根据葡萄糖标准曲线计算酶活力，每分钟水解水杨苷产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1U。对照组中加入沸水浴30min灭活的粗酶液，其它条件均相同，按照式（2）计算酶活力。5.1.4.4木聚糖酶活力按照GB/T23874的规定执行。式中：U—相应纤维素或半纤维素酶活力；m—根据标准曲线方程计算出相应葡萄糖或对硝基苯酚质量（mg）；M—葡萄糖或对硝基苯酚摩尔质量（g/molt—酶解反应时间（min）；1000—转化因子，1mmol=1000μmol；4DB23/T3897—2024n—样品总稀释倍数。5.1.5木质素酶活力测定5.1.5.1漆酶活力取3.3mL100mmol/L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH4.5），加入0.5mL0.5mmol/LABTS（2,2'-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）溶液，加入200μL粗酶液，混匀。在30℃水浴条件下孵育3min，在420nm（3420=36000L·mol-1·cm-1）处测定吸光度变化，三次重复实验。每分钟氧化1μmolABTS所需的酶量为一个酶活单位（U），按照式（3）计算酶活力。5.1.5.2锰过氧化物酶活力取2.5mL50mmol/L琥珀酸-琥珀酸钠缓冲液（pH4.5），加入0.4mL1.6mmol/LMnSO4溶液，加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混匀。在37℃水浴条件下孵育3min，在240nm（3240=6500L·mol-1·cm-1）处测定吸光度变化，三次重复实验。每分钟氧化1μmolMn2+转化为Mn3+所需的酶量为一个酶活单位（U），按照式（3）计算酶活力。5.1.5.3木质素过氧化物酶活力取2.5mL250mmol/L酒石酸-酒石酸钠缓冲液（pH3.0加入0.4mL10mmol/L藜芦醇（VA加入1mL粗酶液，加入100μL10mmol/LH2O2溶液，混匀。在30℃水浴条件下孵育3min，在310nm（3310=9300L·mol-1·cm-1）处测定吸光度变化，三次重复实验。每分钟氧化1μmol的藜芦醇所需的酶量为一个酶活单位（U），按照式（3）计算酶活力。酶酶式中：U—相应木质素酶活力；△A—t时间内吸光度变化值；l—比色皿厚度（cmt—反应时间（min）；V总—反应体系体积（mL）；V酶—反应中酶液的体积（mL）；5.1.6秸秆降解率选择纤维素酶活力、半纤维素酶活力和木质素酶活力高（如占前50%）的突变菌株进行秸秆降解率测定。将选取的突变菌株用液体PDA培养基培养至OD600=0.8，离心去上清，用蒸馏水将菌体重悬获得菌悬液。取烘干的2g秸秆放入50mL经0.22μm的滤膜进行过滤的土壤悬浮液中，然后加入上述调整好的菌液。在15℃条件下培养2周，然后将降解后的秸秆取出放置在80℃中48h烘干。参照NY/T3494，测定秸秆中木质素、纤维素、半纤维素的含量。以第0d为对照组，均进行三次重复。木质素、纤维素、半纤维素的降解率分别按式（456）计算：5DB23/T3897—2024式中：LD—木质素降解率；CD—纤维素降解率；HD—半纤维素降解率；M1—对照组秸秆中木质纤维素含量；M2—处理