药品微生物检验技术 课件 模块二 项目二 微生物总数检查

《药品微生物检验技术》模块二药品安全性检查项目二微生物总数检查

任务一葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查-平皿法

任务二葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查-薄膜过滤法

任务三葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查-最可能数法

目录项目二微生物总数检查任务一葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查-平皿法

任务引入请思考

葡萄糖酸钙口服溶液用于预防和治疗钙缺乏症，如骨质疏松、手足抽搐症、骨发育不全、佝偻病，以及儿童、妊娠和哺乳期妇女、绝经期妇女、老年人钙的补充。某企业生产了一批葡萄糖酸钙口服溶液，根据《中国药典》2020年版要求需要进行微生物限度检查。

请按照供试品取样要求抽取一定数量的葡萄糖酸钙口服溶液，并按照规定确定检验数量、检验量。查询《中国药典》2020年版四部通则1105（非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法），选择平皿法，进行微生物计数，判断被检药品是否符合微生物限度规定。任务分析（１）《中国药典》2020年版规定的微生物计数方法包括平皿法、薄膜过滤法和最可能数法（简称MPN法）。本任务以葡萄糖酸钙口服溶液为材料，选择平皿法进行微生物计数。（２）对微生物计数需要制备适合微生物生长的培养基，并将微生物培养成肉眼可见的菌落。因此，应按照培养基配方完成培养基制备及其适用性检查。任务分析（３）平皿法是《中国药典》2020年版规定的微生物计数方法之一。对于所选择的计数方法还需要进行计数方法适用性试验。（４）按照《中国药典》2020年版规定，确定葡萄糖酸钙口服溶液的检验数量、检验量，保证供试品抽样的客观性，采用无菌操作完成供试品检查。按照规定进行菌落计数并完成检验报告。任务分析本任务的工作内容及要求见下表。工作内容工作要求关键点供试液的制备采取适宜方法制备供试液稀释比例菌液制备选取规定菌株培养，制备菌液菌株选择、培养及菌液制备培养基制备正确选择培养基，完成制备计算、称量、调节pH值、分装、灭菌培养基适用性检查接种培养、计数判定培养、结果判定培养基无菌检查抽检培养基放置于相应培养箱中定期观察计数方法适用性试验试验组、供试品对照组、菌液对照组设置方法适用性判断供试品接种供试品抽样、接种无菌操作阴性对照阴性对照操作对照设计培养及观察培养、观察、记录细菌、真菌培养条件结果判断菌落计数、报告有效结果、检品合格结果相关知识-微生物计数法1.微生物计数法的概念及要求

微生物计数法系用于能在有氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。微生物计数法用于检查非无菌制剂及其原、辅料等是否符合规定的微生物限度标准时，应按《中国药典》2020年版规定进行检验，包括样品的取样量和结果的判断等。除另有规定外，微生物计数法不适用于活菌制剂的检查。

微生物计数试验环境应符合微生物限度检查的要求。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。洁净空气区域、工作台面及环境应定期进行监测。相关知识-微生物计数法２.计数方法

供试品检查时，应根据供试品理化特性和微生物限度标准等因素选择计数方法，检测的样品量应能保证所获得的试验结果能够判断供试品是否符合规定。3.计数培养基适用性检查和供试品计数方法适用性试验

供试品微生物计数中所使用的培养基应进行适用性检查；计数方法应进行方法适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的微生物计数。当检验程序或产品发生变化可能影响检验结果时，计数方法应重新进行适用性试验。相关知识-非无菌药品微生物限度标准

非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径和对患者健康潜在的危害以及药品的特殊性而制订的，不同药品的微生物限度标准不同。药品生产、贮存、销售过程中的检验，药用原料、辅料、中药提取物及中药饮片的检验，新药标准制订，进口药品标准复核，考察药品质量及仲裁等，除另有规定外，其微生物限度均以此标准为依据。任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1查询标准

2培养基制备

3培养基无菌检查4培养基适用性检查5供试液制备6菌液制备7方法适用性试验8供试液接种9培养及观察10结果判断

根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途无菌室操作场所超净工作台操作区域酒精灯局部无菌环境75％乙醇擦拭消毒pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制备供试液胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基为微生物提供营养物质移液器定量移取供试液试管、试管架容器、支架培养皿微生物培养培养箱微生物培养试验菌株培养基适用性检查、方法适用性试验任务实施三、培养基制备培养基名称配方制备1000ml实际制备___ml

制备方式用量计算各用量胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪胨15.0g

琼脂15.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g

氯化钠5.0g

水1000ml

沙氏葡萄糖琼脂培养基动物组织胃蛋白酶水解物胰酪胨等量合物10.0g

琼脂15.0g

葡萄糖40.0g

水1000ml

任务实施四、培养基适用性检查菌液制备和培养基适用性检查培养条件序号步骤操作内容1配制稀释液pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液的配制2配制培养基按规定程序配制所需要的培养基：___________、___________灭菌后备用。3制备菌液（１）取__________、__________、__________、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。（２）取_________的新鲜培养物加入适量含0.05％（体积分数）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（体积分数）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。任务实施四、培养基适用性检查菌液制备和培养基适用性检查培养条件4接种培养（１）取11个无菌平皿，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各______皿，每皿接种量不大于______，最后一皿作为阴性对照。倾倒胰酪大豆胨琼脂培养基（被检培养基）混匀凝固后按规定条件培养，观察计数（需氧菌总数）。对照培养基同法操作。（２）取5个无菌平皿，分别接种______、______各2皿，每皿接种量不大于______，最后一皿作为阴性对照。倾倒沙氏葡萄糖琼脂培养基（被检培养基）混匀凝固后按规定条件培养，观察计数（霉菌和酵母菌总数）。对照培养基同法操作5阴性对照取_______接种培养基后培养，作为阴性对照，阴性对照应_______。任务实施四、培养基适用性检查菌液制备和培养基适用性检查培养条件6定期观察记录（１）胰酪大豆胨琼脂培养基平板，培养温度______，培养时间不超过______天；（２）沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，培养温度______，培养时间不超过______天；观察菌落生长情况，点计平板上生长的菌落数，菌落蔓延生长成片的平板，不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数；7结果判断_______的菌落平均数与_______的菌落平均数的比值应为_______，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；阴性对照_______，则被检培养基适用性检查符合规定。任务实施五、计数方法适用性试验１.供试液的制备２.接种和稀释３.抗菌活性的去除或灭活４.供试品中微生物的回收——平皿法５.结果判断——平皿法任务实施六、供试品检查供试品检查操作记录序号步骤操作内容1配制稀释液pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液的配制2制备培养基__________培养基用于测定需氧菌总数，__________用于测定霉菌和酵母菌总数3制备供试液取供试品10mL，加入_______的_______缓冲液配制成1:10的供试液。取1:10供试液_______加入含9mL_______缓冲液的试管中制成1:102的供试液，再取1:102的供试液1mL加入另一支含9mL_______缓冲液的试管中，制成1:103稀释级的供试液4吸样注皿分别取3个稀释级别的供试液检验，每级稀释液取1mL，置于直径为90mm的无菌平皿中，注入15～20mL温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基，每稀释级每种培养基至少制备_____个平皿5阴性对照吸取稀释液（pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液）1mL，置于直径为90mm的无菌平皿中，注入15～20mL温度不超过45℃熔化的胰酪大豆胨琼脂或沙氏葡萄糖琼脂培养基任务实施六、供试品检查供试品检查操作记录序号步骤操作内容6定期观察记录

胰酪大豆胨琼脂培养基平板，培养温度____，培养时间不超过____天

沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，培养温度____，培养时间不超过____天观察菌落生长情况，点计平板上生长的菌落数，菌落蔓延生长成片的平板，不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数7结果判断阴性对照应____，否则试验无效。若供试品的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数的检查结果均符合规定，判供试品符合规定；若其中任何一项不符合规定，判供试品不符合规定任务实施七、微生物总数检查原始记录表单（平皿法）任务测评序号考核内容考核标准配分得分1培养基制备能正确计算培养基各组分用量5

能正确配制培养基10

能完成培养基灭菌操作5

2培养基的无菌检查能将不同培养基放至相应培养箱中5

能正确判断培养基是否无菌5

3培养基适用性检查能制备各菌种的菌液5

能将菌液接种至相应的培养基中10

能正确完成培养基适用性检查5

4计数方法适用性试验能正确设置验证试验5

能正确进行结果判断5

任务测评序号考核内容考核标准配分得分5供试品接种、培养、结果判断能用无菌操作技术完成供试品接种10

能正确观察供试品培养变化5

能正确判断供试品是否合格10

6培养物处理、无菌室清洁能正确完成培养物处理10

能正确完成无菌室清洁5

合计100项目二微生物总数检查任务二葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查-薄膜过滤法

任务引入请思考

任务一介绍了微生物计数方法中的平皿法，如何使用薄膜过滤法进行葡萄糖酸钙口服溶液的微生物总数检查呢？

请按照供试品取样要求抽取一定数量的葡萄糖酸钙口服溶液，并按照规定确定检验量，查询《中国药典》2020年版四部通则1105（非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法），选择薄膜过滤法，进行微生物计数，判断被检药品是否符合微生物限度规定。

任务分析（１）本任务以葡萄糖酸钙口服溶液为材料，选择薄膜过滤法进行微生物计数。（２）薄膜过滤法是《中国药典》2020年版规定的微生物计数方法之一。薄膜过滤法可以富集样品中的微生物，分离去除样品中对微生物生长产生干扰的因素，有效地提高检验结果的灵敏度和可靠性，是近年来微生物检查领域应用广泛的一种计数手段。任务分析（３）按照《中国药典》2020年版的规定，确定葡萄糖酸钙口服溶液的检验数量、检验量，保证供试品抽样的客观性，采用无菌操作完成供试品检查。按照规定进行菌落计数并完成检验报告。

本任务的工作内容及要求同任务一。相关知识-薄膜过滤法

薄膜过滤法所采用的滤膜孔径应不大于0.45㎛，直径一般为50mm，若采用其他直径的滤膜，冲洗量应进行相应的调整。供试品及其溶剂应不影响滤膜材质对微生物的截留。滤器及滤膜使用前应采用适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。

水溶性供试液过滤前，先过滤少量的冲洗液以润湿滤膜；对于油类供试品，其滤膜和滤器在使用前应充分干燥。为发挥滤膜的最大过滤效率，应注意保持供试品溶液及冲洗液覆盖整个滤膜表面。供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每张滤膜每次冲洗量一般为100mL，总冲洗量一般不超过500mL，最多不得超过1000mL，以避免滤膜上的微生物受到损伤。任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1查询标准

2培养基制备

3培养基无菌检查4培养基适用性检查5供试液制备6菌液制备7计数方法适用性试验8供试液接种9培养及观察10结果判断

根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途无菌室操作场所超净工作台操作区域酒精灯局部无菌环境75％乙醇擦拭消毒ｐＨ7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制备供试液胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基为微生物提供营养物质移液器定量移取供试液试管、试管架容器、支架培养皿微生物培养培养箱微生物培养试验菌株培养基适用性检查、方法适用性试验滤膜及薄膜过滤器富集微生物任务实施三、培养基的制备培养基名称配方制备1000ml实际制备___ml

制备方式用量计算各用量胰酪大豆胨琼脂培养基胰酪胨15.0g

琼脂15.0g

大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g

氯化钠5.0g

水1000ml

沙氏葡萄糖琼脂培养基动物组织胃蛋白酶水解物胰酪胨等量合物10.0g

琼脂15.0g

葡萄糖40.0g

水1000ml

任务实施四、培养基适用性检查培养基适用性检查操作记录序号步骤操作内容1配制稀释液pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液的配制2配制培养基按规定程序配制所需要的培养基：___________、___________灭菌后备用。3制备菌液（１）取__________、__________、__________、白色念珠菌的新鲜培养物，用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液（２）取_________的新鲜培养物加入适量含0.05％（体积分数）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液，将孢子洗脱。采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（体积分数）聚山梨酯80的pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的黑曲霉孢子悬液。任务实施四、培养基适用性检查培养基适用性检查操作记录4接种培养（１）取11个无菌平皿，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉各______皿，每皿接种量不大于______，最后一皿作为阴性对照。倾倒胰酪大豆胨琼脂培养基（被检培养基）混匀凝固后按规定条件培养，观察计数（需氧菌总数）。对照培养基同法操作。（２）取5个无菌平皿，分别接种______、______各2皿，每皿接种量不大于______，最后一皿作为阴性对照。倾倒沙氏葡萄糖琼脂培养基（被检培养基）混匀凝固后按规定条件培养，观察计数（霉菌和酵母菌总数）。对照培养基同法操作。5阴性对照取_______接种培养基后培养，作为阴性对照，阴性对照应_______。任务实施四、培养基适用性检查培养基适用性检查操作记录6定期观察记录（１）胰酪大豆胨琼脂培养基平板，培养温度______，培养时间不超过______天；（２）沙氏葡萄糖琼脂培养基平板，培养温度______，培养时间不超过______天；观察菌落生长情况，点计平板上生长的菌落数，菌落蔓延生长成片的平板，不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数。7结果判断_______的菌落平均数与_______的菌落平均数的比值应为_______，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致；阴性对照_______，则被检培养基适用性检查符合规定。任务实施五、计数方法适用性试验１.供试液的制备２.接种和稀释３.抗菌活性的去除或灭活４.供试品中微生物的回收——薄膜过滤法５.结果判断——薄膜过滤法任务实施六、供试品检查供试品检查操作记录序号步骤操作内容1配制稀释液pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液的配制2制备培养基__________培养基用于测定需氧菌总数，__________培养基用于测定霉菌和酵母菌总数3制备供试液按平皿法制备1:10的供试液_______mL4装膜将装有滤膜的薄膜过滤器安装在带有真空装置的支架上5润膜薄膜过滤器中倒入pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液50mL，打开真空阀润洗滤膜，润洗一次6样品过膜将适量pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液倒入薄膜过滤器，移取10mL供试液至缓冲液中，打开真空阀过滤样品任务实施六、供试品检查供试品检查操作记录序号步骤操作内容7冲洗将约100mLpH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液倒入薄膜过滤器中，打开真空阀冲洗滤膜，冲洗不少于3次8贴膜用镊子轻轻取出过滤膜，菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中心9阴性对照取相应稀释液过滤、冲洗，作为阴性对照10培养将贴有滤膜的平板倒置放入培养箱中11结果判断若滤膜上有菌落生长，进行菌落计数，以相当于1g、1mL或10cm2供试品的菌落数报告菌数任务实施七、微生物总数检查原始记录表单（薄膜过滤法）任务测评序号考核内容考核标准配分得分1培养基制备能正确计算培养基各组分用量5

能正确配制培养基10

能完成培养基灭菌操作5

2培养基的无菌检查能将不同培养基放至相应培养箱中5

能正确判断培养基是否无菌5

3培养基适用性检查能制备各菌种的菌液5

能将菌液接种至相应的培养基中10

能正确完成培养基适用性检查5

4计数方法适用性试验能正确设置验证试验5

能正确进行结果判断5

任务测评序号考核内容考核标准配分得分5供试品接种、培养、结果判断能用无菌操作技术完成供试品接种10

能正确观察供试品培养变化5

能正确判断供试品是否合格10

6培养物处理、无菌室清洁能正确完成培养物处理10

能正确完成无菌室清洁5

合计100项目二微生物总数检查任务三葡萄糖酸钙口服液的微生物总数检查-最可能数法

任务引入请思考

任务一与任务二分别介绍了微生物计数方法中的平皿法和薄膜过滤法，如何使用最可能数法进行葡萄糖酸钙口服溶液的微生物总数检查呢？

请按照供试品取样要求抽取一定数量的葡萄糖酸钙口服溶液，并按照规定确定检验量，查询《中国药典》2020年版四部通则1105（非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法），选择最可能数法，进行微生物计数，判断被检药品是否符合微生物限度规定。任务分析（１）本任务以葡萄糖酸钙口服溶液为材料，选择最可能数法进行微生物计数。（２）按照《中国药典》2020年版规定，确定葡萄糖酸钙口服溶液的检验数量、检验量，保证供试品抽样的客观性，采用无菌操作完成供试品检查。按照规定进行菌落计数并完成检验报告。

本任务的工作内容及要求同任务一。相关知识-最可能数法

最可能数法（MPN法）用于微生物计数时精密度和准确度不及薄膜过滤法和平皿法，但对于某些微生物污染量很小的供试品，最可能数法可能是更适合的方法，仅在供试品需氧菌总数没有适宜计数方法的情况下使用。最可能数法不适用于霉菌计数。任务实施一、制订工作计划序号工作内容完成时间成员负责人1查询标准

2培养基制备

3培养基无菌检查4培养基适用性检查5供试液制备6菌液制备7计数方法适用性试验8供试液接种9培养及观察10结果判断

根据任务要求，制定合理工作进度计划，并根据小组成员的特点进行分工。任务实施二、试验前准备设备、器材、试剂规格数量用途无菌室操作场所超净工作台操作区域酒精灯局部无菌环境75％乙醇擦拭消毒ｐＨ7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制备供试液胰酪大豆胨液体培养基为微生物提供营养物质移液器定量移取供试液试管、试管架容器、支架培养箱微生物培养试验菌株培养基适用性检查、方法适用性试验补充1补充2任务实施三、培养基的制备培养基名称配方制备1000ml实际制备___ml

制备方式用量计算各用量胰酪大豆胨液体培养基胰酪胨17.0g

葡萄糖/无水葡萄糖2.5g/2.3g

大豆木瓜蛋白酶水解物3.0g

氯化钠5.0g

磷酸氢二钾2.5g

水1000ml任务实施四、培养基适用性检查培养基适用性检查操作记录序号步骤操作内容1配制稀释液pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液的配制。2配制培养基按规定程序配制所需要的培养基：___________。灭菌后备用。3制备菌液取__________、__________、__________用pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液制成适宜浓度的菌悬液。4接种培养取_____支无菌试管，分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌各_____管，每管接种不大于_____的菌液，最后一管作为阴性对照。按规定条件培养，观察计数（需氧菌总数）。对照培养管同法操作。任务实施四、培养基适用性检查培养基适用性检查操作记录5阴性对照取_______接种培养基后培养，作为阴性对照，阴性对照应_______