《微生物细胞培养》课件

《微生物细胞培养》欢迎来到微生物细胞培养的世界！本课程将带您深入了解微生物细胞培养的基础知识、技术和应用。从培养基的选择到细胞的保存，我们将一步步探索微生物生长的奥秘，为您打开微生物研究的大门。课程介绍：微生物细胞培养的重要性基础研究微生物细胞培养是研究微生物生命活动规律的基础。通过细胞培养，我们可以深入了解微生物的生长、代谢、遗传等特性，为生命科学的探索提供重要依据。应用研究微生物细胞培养在医药、食品、农业、环保等领域具有广泛的应用。例如，抗生素的筛选、疫苗的生产、食品的发酵、污染物的降解等都离不开微生物细胞培养技术。培养基的种类与选择1按物理状态分类培养基按物理状态可分为液体培养基、固体培养基和半固体培养基。不同的物理状态适用于不同的培养目的和微生物类型。2按化学成分分类培养基按化学成分可分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。不同的化学成分能够满足不同微生物的营养需求。3按用途分类培养基按用途可分为普通培养基、选择性培养基、鉴别培养基和增菌培养基。不同的用途能够帮助我们筛选、鉴定和富集特定的微生物。液体培养基：成分与制备成分液体培养基的主要成分包括水、碳源、氮源、无机盐和生长因子。这些成分为微生物的生长提供必需的营养物质。制备液体培养基的制备包括称量、溶解、调节pH值、分装和灭菌等步骤。严格的操作流程能够保证培养基的质量和无菌性。应用液体培养基适用于大规模培养、代谢产物研究和动态生长监测等应用。其流动性能够促进微生物与营养物质的充分接触。固体培养基：成分与制备成分固体培养基是在液体培养基的基础上加入凝固剂（如琼脂）制成的。琼脂能够使培养基形成固体，便于微生物的生长和观察。制备固体培养基的制备包括称量、溶解、加热、加入琼脂、调节pH值、分装和灭菌等步骤。需要特别注意琼脂的溶解和均匀混合。应用固体培养基适用于菌落形态观察、纯培养分离和菌种保存等应用。其固体表面能够支持微生物形成独立的菌落。半固体培养基：成分与制备1成分半固体培养基是在液体培养基的基础上加入少量凝固剂制成的。其凝固剂含量低于固体培养基，使其呈现半流动的状态。2制备半固体培养基的制备与固体培养基类似，但需要精确控制凝固剂的含量，以保证培养基的半流动性。3应用半固体培养基适用于微生物运动性观察、微需氧菌培养和某些特殊用途的培养。其半流动性能够支持微生物的缓慢扩散。特殊培养基：选择性培养基定义选择性培养基是指含有某些特定成分，能够抑制某些微生物生长，而允许另一些微生物生长的培养基。原理选择性培养基通过改变培养基的成分，如添加抗生素、高盐浓度、特定pH值等，来创造不利于某些微生物生长的环境。应用选择性培养基适用于从复杂样品中分离特定的微生物。例如，添加抗生素的选择性培养基可以用于分离耐药菌株。特殊培养基：鉴别培养基定义鉴别培养基是指含有某些特定成分，能够使不同微生物在培养基上呈现不同特征的培养基。1原理鉴别培养基通过添加指示剂或底物，使不同微生物因其代谢产物的不同而呈现不同的颜色或形态特征。2应用鉴别培养基适用于快速鉴定和区分不同的微生物。例如，麦康凯培养基可以用于区分发酵乳糖和不发酵乳糖的肠道菌。3特殊培养基：增菌培养基1定义增菌培养基是指含有某些特定成分，能够促进目标微生物生长，抑制其他微生物生长的培养基。2原理增菌培养基通过提供目标微生物所需的特殊营养物质或生长条件，使其在竞争中占据优势。3应用增菌培养基适用于从低浓度样品中富集目标微生物。例如，亚硒酸盐胱氨酸培养基可以用于富集沙门氏菌。培养基的灭菌方法1目的培养基的灭菌是为了杀灭其中可能存在的微生物，保证培养过程的无菌性，防止污染。2方法常用的灭菌方法包括高压蒸汽灭菌、干热灭菌、过滤灭菌和紫外线灭菌等。选择合适的灭菌方法需要根据培养基的性质和用途。3重要性严格的灭菌是微生物细胞培养成功的关键。任何疏忽都可能导致污染，影响实验结果的准确性。高压蒸汽灭菌法：原理与操作高压蒸汽灭菌法是利用高温高压的饱和蒸汽杀灭微生物。其原理是高温能够使微生物的蛋白质变性，导致其死亡。常用的条件是121℃，15-20分钟。操作时需要注意排气、升温、保温和降温等环节，确保灭菌效果。干热灭菌法：原理与操作原理干热灭菌法是利用高温干燥的空气杀灭微生物。其原理是高温能够使微生物的蛋白质氧化变性，导致其死亡。常用的条件是160-170℃，2小时。操作操作时需要将物品置于干燥的容器中，避免潮湿。干热灭菌适用于耐高温的玻璃器皿、金属器械和粉末等物品。注意事项需要注意的是，干热灭菌的穿透力较差，因此不适用于液体和含有水分的物品。同时，温度控制需要精确，避免温度过高导致物品损坏。过滤灭菌法：原理与操作过滤灭菌法是利用滤膜的微孔阻挡微生物通过，从而达到灭菌的目的。其原理是滤膜的孔径小于微生物的尺寸，能够将其截留在滤膜上。常用的滤膜孔径为0.22μm。过滤灭菌适用于不耐高温的液体，如血清、维生素和某些抗生素等。操作时需要注意滤膜的完整性和无菌性，避免污染。其他灭菌方法：紫外线灭菌原理紫外线灭菌是利用紫外线的辐射杀灭微生物。其原理是紫外线能够破坏微生物的DNA结构，导致其死亡。紫外线灭菌适用于空气、水和物体表面的灭菌。操作操作时需要将物品暴露在紫外线下，照射时间通常为30-60分钟。需要注意的是，紫外线的穿透力较差，因此不适用于深层物体的灭菌。同时，需要保护眼睛和皮肤，避免受到紫外线的伤害。微生物细胞的接种技术1定义接种是指将微生物转移到无菌的培养基中的过程。接种是微生物细胞培养的重要步骤，直接影响培养的成功与否。2目的接种的目的是获得纯培养，进行菌种鉴定、保藏和后续实验。无菌操作是接种成功的关键。3工具常用的接种工具包括接种环、接种针、吸管和涂布器等。根据不同的培养目的和微生物类型，选择合适的接种工具。液体培养的接种方法直接滴加法使用无菌吸管或接种环，将少量菌液直接滴加到液体培养基中。适用于菌液浓度较高的样品。倾注法将菌液与融化的固体培养基混合后，倾注到无菌培养皿中。适用于菌液浓度较低的样品。搅拌法使用磁力搅拌器或摇床，将菌液与液体培养基充分混合。适用于大规模培养。固体培养的接种方法平板划线法使用接种环在固体培养基表面进行划线，使菌液逐渐稀释，获得单个菌落。适用于纯培养分离。稀释涂布平板法将菌液进行系列稀释后，取少量菌液涂布到固体培养基表面。适用于活菌计数。穿刺接种法使用接种针将菌液穿刺到半固体培养基中。适用于微生物运动性观察。斜面培养的接种方法1目的斜面培养主要用于菌种的保藏和运输。斜面培养基的表面积较大，有利于微生物的生长。2方法使用接种环或接种针，将菌液在斜面培养基表面进行划线。需要注意的是，划线时要避免划破培养基表面。3注意事项接种后，将斜面培养基置于适宜的温度下培养。待微生物生长后，将其置于低温或干燥的环境中保存。平板划线法：操作步骤准备准备无菌固体培养基、接种环、酒精灯和待接种的菌液。灭菌将接种环在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后蘸取少量菌液。划线在固体培养基表面进行连续划线，每次划线前都要将接种环烧灼灭菌。培养将划线后的培养基置于适宜的温度下培养，观察菌落的生长情况。稀释涂布平板法：操作步骤准备准备无菌固体培养基、无菌吸管、涂布器和待接种的菌液。1稀释将菌液进行系列稀释，常用的稀释梯度为10倍。2涂布取少量稀释后的菌液，用涂布器均匀涂布到固体培养基表面。3培养将涂布后的培养基置于适宜的温度下培养，计数菌落数量。4穿刺接种法：操作步骤1准备准备无菌半固体培养基、接种针和待接种的菌液。2灭菌将接种针在酒精灯火焰上烧灼灭菌，冷却后蘸取少量菌液。3穿刺将接种针垂直穿刺到半固体培养基中，深度约为培养基的一半。微生物的培养条件1温度不同的微生物对温度的要求不同。根据微生物的生长温度范围，可分为嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌。2pH值不同的微生物对pH值的要求不同。大多数微生物适宜在pH值为6.5-7.5的范围内生长。3氧气根据对氧气的需求，微生物可分为好氧菌、厌氧菌、兼性厌氧菌和微需氧菌。温度对微生物生长的影响温度（℃）生长速率温度是影响微生物生长的重要因素之一。在一定的温度范围内，微生物的生长速率随着温度的升高而加快。但当温度超过最适生长温度时，微生物的生长速率会迅速下降。不同的微生物有不同的最适生长温度。pH值对微生物生长的影响酸性一些微生物能够在酸性条件下生长，被称为嗜酸菌。例如，醋酸菌能够将乙醇氧化为乙酸，导致pH值下降。中性大多数微生物适宜在中性或接近中性的条件下生长。例如，大肠杆菌的最适pH值约为7.0。碱性一些微生物能够在碱性条件下生长，被称为嗜碱菌。例如，某些芽孢杆菌能够利用碱性物质，导致pH值升高。氧气对微生物生长的影响好氧菌好氧菌必须在有氧气的条件下才能生长。它们利用氧气进行呼吸作用，产生能量。厌氧菌厌氧菌在有氧气的条件下不能生长，甚至会被氧气杀死。它们利用其他物质进行呼吸作用，或进行发酵作用。兼性厌氧菌兼性厌氧菌既能在有氧气的条件下生长，也能在无氧气的条件下生长。它们可以根据环境条件选择呼吸作用或发酵作用。湿度对微生物生长的影响1水分水分是微生物生长的重要因素之一。微生物需要足够的水分才能进行代谢活动和繁殖。因此，保持适宜的湿度对于微生物的生长至关重要。2影响湿度过低会导致微生物脱水死亡，湿度过高则容易滋生杂菌。因此，需要根据微生物的类型和培养目的，控制好培养环境的湿度。3控制在实验室中，可以通过加湿器、干燥器等设备来控制湿度。在工业生产中，则需要更加精密的湿度控制系统。营养物质对微生物生长的影响碳源碳源是微生物合成细胞物质和获取能量的重要来源。常用的碳源包括葡萄糖、蔗糖、乳糖等。氮源氮源是微生物合成蛋白质、核酸等含氮化合物的重要来源。常用的氮源包括蛋白胨、牛肉膏、酵母提取物等。无机盐无机盐是微生物生长所必需的矿物质元素。常用的无机盐包括磷酸盐、硫酸盐、氯化物等。微生物的生长曲线迟缓期微生物刚进入新的环境时，需要适应一段时间才能开始生长繁殖。对数期微生物以最大的速率生长繁殖，细胞数量呈指数增长。稳定期微生物的生长速率与死亡速率达到平衡，细胞数量基本不变。迟缓期：定义与特点1定义迟缓期是指微生物接种到新的培养基后，在开始快速生长之前的一段时间。在此期间，细胞数量几乎没有增加。2特点微生物在此期间主要进行适应新环境、合成酶类和修复损伤等活动。迟缓期的长短取决于微生物的种类、培养基的成分和接种量等因素。3影响缩短迟缓期可以提高培养效率。可以通过预培养、增加接种量和优化培养基成分等方法来缩短迟缓期。对数期：定义与特点定义对数期是指微生物经过迟缓期后，以最大的生长速率进行繁殖的时期。在此期间，细胞数量呈指数增长，在半对数坐标图中呈直线。特点微生物在此期间的生理状态最为活跃，代谢产物产量最高。对数期是研究微生物生理特性和进行工业生产的最佳时期。影响对数期的长短取决于微生物的种类、培养基的成分和培养条件等因素。可以通过优化培养条件来延长对数期。稳定期：定义与特点定义稳定期是指微生物经过对数期后，生长速率与死亡速率达到平衡的时期。在此期间，细胞数量基本不变，生长曲线趋于平缓。1特点微生物在此期间的营养物质逐渐耗尽，代谢产物积累，生长受到抑制。稳定期是研究微生物耐受性和进行二次代谢产物生产的时期。2影响稳定期的长短取决于微生物的种类、培养基的成分和培养条件等因素。可以通过优化培养条件来延长稳定期。3衰亡期：定义与特点1定义衰亡期是指微生物经过稳定期后，死亡速率超过生长速率的时期。在此期间，细胞数量逐渐减少，生长曲线下降。2特点微生物在此期间的营养物质耗尽，有毒代谢产物积累，细胞逐渐死亡。衰亡期是微生物生命活动的最终阶段。3影响延长衰亡期可以提高代谢产物的产量。可以通过添加营养物质、去除有毒代谢产物等方法来延长衰亡期。影响生长曲线的因素1营养物质营养物质的种类和浓度直接影响微生物的生长速率和细胞数量。2环境条件温度、pH值、氧气和湿度等环境条件影响微生物的生长和代谢。3微生物种类不同的微生物具有不同的生长特性和对环境的适应能力。微生物细胞的计数方法微生物细胞的计数方法主要分为直接计数法和间接计数法。直接计数法可以直接测定细胞数量，如显微镜直接计数法和血球计数板计数法。间接计数法通过测定与细胞数量相关的指标来推算细胞数量，如活菌计数法和比浊法。选择合适的计数方法需要根据实验目的和样品性质。显微镜直接计数法原理将一定量的样品置于显微镜下，直接计数视野中的细胞数量。该方法可以快速获得总细胞数，但无法区分死细胞和活细胞。操作将样品稀释后，取一定量滴于载玻片上，覆盖盖玻片，在显微镜下计数。需要注意的是，细胞分布要均匀，视野选择要具有代表性。应用显微镜直接计数法适用于细胞数量较多的样品，如细菌悬液和酵母菌悬液。该方法简单易行，但精度较低。血球计数板计数法原理血球计数板是一种带有特定刻度和容积的载玻片。将样品滴于血球计数板上，在显微镜下计数特定区域内的细胞数量。该方法可以精确测定细胞数量，但操作较为繁琐。操作将样品稀释后，取一定量滴于血球计数板上，静置一段时间后，在显微镜下计数特定区域内的细胞数量。需要注意的是，细胞分布要均匀，计数规则要明确。活菌计数法：稀释涂布平板法1原理将样品进行系列稀释后，取少量稀释液涂布到固体培养基表面。培养一段时间后，计数培养基上的菌落数量。每个菌落代表一个活细胞，因此可以根据菌落数量推算样品中的活细胞数量。2操作将样品进行系列稀释，取少量稀释液涂布到固体培养基表面，用涂布器均匀涂布。培养一段时间后，计数培养基上的菌落数量。3应用稀释涂布平板法适用于测定样品中的活细胞数量。该方法操作简便，结果可靠，但只能测定能够形成菌落的细胞数量。比浊法：原理与应用原理微生物悬液的浊度与其细胞浓度成正比。利用分光光度计测定微生物悬液的吸光度值，可以间接反映其细胞浓度。操作将微生物悬液置于分光光度计的比色皿中，测定其在特定波长下的吸光度值。通常选择600nm作为测定波长。应用比浊法适用于快速测定微生物悬液的相对细胞浓度。该方法简单易行，但需要建立吸光度值与细胞浓度之间的标准曲线。培养过程中的污染控制无菌操作严格遵守无菌操作规范，是防止污染的关键。消毒灭菌对实验环境、器械和培养基进行彻底的消毒灭菌。环境控制保持实验环境清洁，减少空气中的微生物数量。无菌操作的重要性1保证实验结果的准确性污染会导致实验结果出现偏差，甚至无法得出正确的结论。2防止有害微生物的扩散某些微生物具有致病性，污染会导致这些微生物扩散，威胁人体健康。3延长培养物的使用寿命污染会导致培养物变质，缩短其使用寿命。污染来源分析空气空气中含有大量的微生物，是污染的重要来源。实验人员实验人员的皮肤、呼吸道和衣物都可能携带微生物，导致污染。实验器械未经过彻底消毒灭菌的实验器械是污染的重要来源。培养基未经过彻底灭菌的培养基含有微生物，是污染的直接来源。常用消毒剂及其使用方法酒精75%的酒精可以有效杀灭细菌、真菌和病毒。适用于皮肤、物体表面和小型器械的消毒。1次氯酸钠次氯酸钠具有强氧化性，可以杀灭各种微生物。适用于物体表面、地面和污水的消毒。2过氧乙酸过氧乙酸具有广谱杀菌作用，可以杀灭各种微生物，包括芽孢。适用于空气、物体表面和医疗器械的消毒。3超净工作台的使用1原理超净工作台通过过滤空气，形成无菌环境，保护实验材料免受污染。2操作在使用前，开启紫外灯照射30分钟，再开启风机运行10分钟。操作时，双手和实验材料都要在工作台的有效范围内。3注意事项定期更换过滤器，保持工作台的清洁。避免在工作台内进行产生大量尘埃的操作。微生物的保存方法1目的为了长期保存微生物，防止其变异或死亡，需要采取合适的保存方法。2方法常用的保存方法包括低温保存法、甘油保存法、干燥保存法、液氮保存法和冷冻干燥保存法等。3选择选择合适的保存方法需要根据微生物的种类、特性和保存时间等因素。低温保存法：原理与操作低温保存法是利用低温抑制微生物的代谢活动，从而达到保存的目的。常用的温度包括4℃、-20℃和-80℃。操作时需要将微生物悬液加入保护剂（如甘油），以防止冰晶对细胞造成损伤。低温保存适用于大多数微生物，但保存时间有限。甘油保存法：原理与操作原理甘油是一种常用的保护剂，可以防止冰晶对细胞造成损伤。将微生物悬液加入甘油后，可以在低温下长期保存。操作将微生物悬液与甘油混合，使甘油终浓度为15%-20%。分装到无菌冻存管中，置于-80℃或液氮中保存。注意事项甘油必须是无菌的。解冻时要迅速，避免冰晶对细胞造成损伤。干燥保存法：原理与操作原理干燥保存法是利用干燥去除微生物细胞中的水分，使其代谢活动停止，从而达到保存的目的。常用的方法包括自然干燥和真空干燥。操作将微生物悬液涂布到无菌载体上（如硅胶），在干燥的环境中放置一段时间。然后将载体置于密封容器中保存。液氮保存法：原理与操作1原理液氮的温度极低（-196℃），可以使微生物细胞的代谢活动完全停止，从而达到长期保存的目的。液氮保存是目前最常用的长期保存方法之一。2操作将微生物悬液加入保护剂（如甘油），分装到无菌冻存管中，置于液氮中保存。需要注意的是，操作时要避免液氮溅出，防止冻伤。3注意事项解冻时要迅速，避免冰晶对细胞造成损伤。使用时要戴防护手套和面罩，防止液氮溅出。冷冻干燥保存法：原理与操作原理冷冻干燥保存法是将微生物悬液冷冻后，在真空条件下将水分升华去除，从而达到保存的目的。冷冻干燥后的微生物可以在常温下长期保存。操作将微生物悬液加入保护剂（如脱脂牛奶），冷冻后置于冷冻干燥机中进行干燥。干燥后的微生物置于密封容器中保存。应用冷冻干燥保存法适用于保存细菌、真菌和病毒等微生物。该方法可以长期保存微生物，且复苏率高。常见微生物的培养实例大肠杆菌革兰氏阴性菌，常用于分子生物学研究。金黄色葡萄球菌革兰氏阳性菌，是常见的致病菌。酵母菌单细胞真菌，常用于食品发酵和生物工程。大肠杆菌的培养1培养基LB培养基是培养大肠杆菌常用的培养基。其成分简单，能够满足大肠杆菌的生长需求。2温度大肠杆菌的最适生长温度为37℃。在此温度下，大肠杆菌的生长速率最快。3氧气大肠杆菌是兼性厌氧菌，既能在有氧气的条件下生长，也能在无氧气的条件下生长。金黄色葡萄球菌的培养培养基营养琼脂培养基或血琼脂培养基是培养金黄色葡萄球菌常用的培养基。血琼脂培养基可以观察金黄色葡萄球菌的溶血现象。温度金黄色葡萄球菌的最适生长温度为37℃。在此温度下，金黄色葡萄球菌的生长速率最快。氧气金黄色葡萄球菌是兼性厌氧菌，既能在有氧气的条件下生长，也能在无氧气的条件下生长。酵母菌的培养培养基YPD培养基是培养酵母菌常用的培养基。其成分丰富，能够满足酵母菌的生长需求。1温度酵母菌的最适生长温度为28-30℃。在此温度下，酵母菌的生长速率最快。2氧气酵母菌是兼性厌氧菌，既能在有氧气的条件下生长，也能在无氧气的条件下生长。在有氧气的条件下，酵母菌进行有氧呼吸，产生大量的能量。在无氧气的条件下，酵母菌进行发酵，产生酒精和二氧化碳。3霉菌的培