342微生物制药省公开课一等奖全国示范课微课金奖课件

第二章微生物制药第1页一、微生物药品几个相关基本概念二、微生物药品分类三、微生物药品应用四、药源微生物及微生物药品筛选技术五、微生物药品发酵生产技术六、微生物药品分离、精制和判别七、废弃物综合利用和环境保护第2页四、药源微生物及微生物药品筛选技术（一）药品产生菌（二）新药产生菌分离（三）新微生物药品筛选（四）微生物药品产生菌菌种改良（五）微生物药品产生菌保藏第3页（二）新药产生菌分离1、土壤微生物分离土壤是微生物主要栖息地。（1）采集样品（2）分离微生物（3）选留菌种及保留分离放线菌样品除土壤以外，还有河（湖、海）泥和水、枯树叶、堆肥、动物粪便等。土壤样品通常采表层土（5cm以下），样品以未开垦过土壤为佳，要尽可能选择不一样地理和生态环境土壤。

第4页1、土壤微生物分离（1）采集样品（2）分离微生物（3）选留菌种及保留样品处理分离培养基抑制剂使用分离方法培养条件稀有放线菌选择性分离其它微生物分离第5页利用放线菌孢子和细菌营养细胞及不一样属间放线菌孢子间耐性差异，用物理或化学方法除去细菌及目标外放线菌，或者用花粉作为诱饵，增加一些特定放线菌分出率。分离前样品加热处理处理条件样品分离放线菌40℃，2～16h土壤、植物根链霉菌55℃，6min水、土壤、粪便小单孢菌、链霉菌、红球菌、嗜酸放线菌和嗜碱放线菌等55℃干热，10d土壤高温放线菌100℃干热，15min土壤马杜拉放线菌100～120℃干热，1h土壤马杜拉放线菌、小双孢菌，小四孢菌，孢囊链霉菌样品处理A）温度第6页B）化学试剂处理SDS-酵母膏处理法，SDS对放线菌孢子基本无害，酵母浸膏以及温和热休克能够促进放线菌孢子出芽，使细菌数显著降低。风干土壤与CaCO3混合后在26℃培养7～9d，然后分离放线菌。风干土壤降低了细菌数量，CaCO3有利于放线菌生长而不利于绝大多数真菌生长。用0.01mol/LNaOH处理土壤5～10min（15℃）可降低细菌数量，有利于分离小单孢菌。用1.4%酚处理土样10min或用1.4%酚130℃处理30min，分别有利于取得链霉菌或小单孢菌。用乙酸乙酯或氯仿和苯处理样品，过滤风干后用来分离微生物，能够除去样品中真菌。第7页C）物理方法处理离心，1600g离心20min，上清液主要有放线菌孢子，沉淀含有细菌和真菌孢子。超声波处理，分离小单孢菌和链霉菌。特殊器具捕集空气中游离孢子，分离糖多孢菌。搅动，使干草上孢子脱落，用于从干草中分离高温放线菌。膜过滤，将水经膜（孔径0.45滤膜）过滤，浓缩水中微生物，再将膜直接贴在琼脂平板上培养。诱饵法，在培养基中添加特殊物质，如花粉、蛇皮、头发等，可分离小瓶菌和发仙菌。第8页分离培养基合成培养基——精氨酸培养基，高氏合成一号培养基，天门冬素培养基，察氏培养基等有机培养基——Waksman培养基，Bennett培养基几丁质培养基——只有放线菌能够利用几丁质，生长菌落小，白色，需转接到产可溶性色素适当培养基上加以区分HV培养基——以土壤腐殖质为唯一碳源和氮源培养基总要求：尽可能使样品中全部放线菌都生长出来，而其它微生物（细菌和真菌）又尽可能不长。第9页选择性分离放线菌所使用培养基待分离放线菌所用固体培养基中主要成份马杜拉放线菌属葡萄糖，甘油，L-天冬酰胺，微量盐，维生素（AV培养基）小双孢菌属AV培养基小单孢菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）小四孢菌属下层：葡萄糖，L-天冬酰胺，微量盐上层：（水解）酪蛋白氨基酸诺卡菌属微量盐，丙酸钠，硫胺素（M3培养基）嗜高温放线菌属半浓度营养琼脂链孢囊菌属葡萄糖，L-天冬胺酰，微量盐（NH2），维生素，土壤浸出液各种菌属胶体几丁质，微量盐第10页抑制剂使用加入抗真菌试剂（制霉菌素、两性霉素B、放线菌酮、丙酸钠以及使真菌形成较小菌落rosebengal等），抑制真菌生长；加入抗细菌抗生素（青霉素、链霉素）抑制细菌生长，增加放线菌分出率；加入一些抗生素也可抑制部分放线菌，有利于分离到一定种类放线菌。如新生霉素有利于分离北里孢菌属。第11页分离方法稀释法干土喷射法孢子飞扬法滤膜法——最惯用，将土壤样品用无菌水（或生理盐水、磷酸缓冲液）制成悬液，倍比稀释，涂布平板，恒温培养。——用喷土机或其它方法将风干碾细土样直接喷在分离平板上。——将0.22~0.45μm滤膜放在分离平板上，接种菌悬液或喷撒干土，适温培养一段时间，放线菌菌丝可穿过滤膜小孔生长到培养基上，细菌只能在滤膜表面生长，去掉滤膜，深入培养基放线菌经继续培养后长出菌落。——将样品置于特制瓶中，其瓶口刚好能倒置一个分离平板，猛烈振荡使孢子飞扬，撞到分离平板上进行分离培养。第12页培养条件普通培养温度为25~30℃，也有32~37℃，培养7～14d，生长慢放线菌可延长培养1个月；分离高温放线菌用45～50℃培养1～2d；海水放线菌用20℃培养6周左右。第13页稀有放线菌选择性分离稀有放线菌特征：生长速度比较迟缓；营养需求较为复杂；比较缺乏孢子分化能力；不能稳定保留。第14页分离几个稀有放线菌方法待分离稀有放线菌种类形态特征预处理方法分离方法分离方法特征马杜拉放线菌100℃加热15min，并悬浮于无菌25％（V/V）Ringer’s溶液中悬浮液涂布于含有100μg/mL放线菌酮、25μg/mL利福平固体培养基上高温处理土样与使用含有利福平固体培养基相结合选择性分离方法游动放线菌不形成真正气生菌丝，而且菌落呈鲜艳橘黄色。营养菌丝上形成孢子囊。游动孢子由成熟孢子囊产生。土样浸泡于饱和硫酸镁盐溶液中，再洗去镁盐，干燥土样。将经过干湿处理后土样涂布于几丁质琼脂上，可得到大量游动放线菌利用了生物趋化方法小单孢菌大多数种缺乏气生菌丝，形成橘黄色或橘红色菌落孢子；分化菌落表面变成黑色或暗褐色，有时呈光滑或粘稠。单孢子只在营养菌丝上形成，没有运动性。碱处理有效降低了革兰氏阴性细菌生长含有衣霉素固体培养基可选择性支持小单孢菌生长将土样进行碱处理和使用含有衣霉素固体培养基相结合独特方法第15页分离几个稀有放线菌方法待分离稀有放线菌种类形态特征预处理方法分离方法分离方法特征诺卡菌大多数种形成腊样或有光泽菌落而不形成气生菌丝，但也有一些种会产生不成熟气生菌丝，营养菌丝可断裂成球状或杆状片断用石蜡棒在土壤样品悬液中富集然后将石蜡从棒上剥离，接种到DST（Oxoid）琼脂平板上，25℃培养3w链孢囊菌营养和气生菌丝与链霉菌菌株一样发育良好，包含着不能移动孢子孢囊位于气生菌丝顶端可先将土样在室温风干，然后在120℃加热1h将处理后土样或用土壤悬液涂布于含有维生素培养基上北里孢菌属形态特征以及菌落特征与链霉菌属非常相同，但它们细胞壁中含有LL-DAP、meso-DAP、甘氨酸、半乳糖，与链霉菌属完全不一样50μg/mL新生霉素培养基利用了北里孢菌属菌种对新生霉素含有抗性特征第16页其它微生物分离真菌分离惯用马铃薯葡萄糖琼脂培养基、Martin培养基、察氏蔗糖（葡萄糖）琼脂培养基，pH偏酸性。为了抑制细菌生长普通在分离培养基中加入β-内酰胺类和氨基糖苷类等抗生素。细菌分离惯用有机培养基，如牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、营养琼脂加氨基酸维生素培养基等，pH偏碱性。分离时普通加入一定量抗真菌抗生素如制霉菌素、两性霉素、放线菌酮等，抑制真菌生长，有利于细菌分离。加入多粘菌素可大大降低G－细菌生长，使G＋细菌得以富集。第17页1、土壤微生物分离（1）采集样品（2）分离微生物（3）选留菌种及保留将菌株优良特征保留下来，保持微生物活力。低温保藏法传代培养保藏法液体石蜡保藏法沙土保藏法冷冻干燥保藏法第18页2、海洋微生物分离第19页Okami等从海洋中分离放线菌程序①目标从海水和海底沉淀物中分离放线菌②分离样品用采样器采集海水和海底沉淀物③前处理离心和过滤海水抵达浓缩，沉淀物直接涂平板④培养基各种培养基，包含含人造海水一些培养基（淀粉－水解酪蛋白－海水）⑤培养20℃，6w⑥挑选菌落挑出全部放线菌菌落⑦结果有几株产生新抗生素菌种，包含沉淀物中得到产生aplasmomycinStr.griseus第20页分离海洋放线菌培养基：（1）SC培养基：（2）Z培养基：（3）普通分离放线菌培养基适当稀释，再加入人造海水可溶性淀粉10g酪蛋白1g人造海水500ml蒸馏水500ml琼脂1.7%pH7.4蛋白胨5g磷酸铁0.1g酵母膏1g人造海水1000ml琼脂1.7%pH7.6第21页3、极端微生物分离极端微生物是在特殊环境（如高温、低温、高盐、高碱、高压等）中形成一类特殊微生物，因而在分离这类微生物时，需考虑它们生长繁殖所需特殊条件，以设计分离与培养条件。分离嗜热微生物，有些菌株最适生长温度高达80℃，pH在1－6；分离嗜盐微生物时培养基中盐浓度可高达2.5mol/L。第22页4、其它微生物资源粘细菌基因重组微生物利用基因工程技术构建产生新次级代谢产物基因重组微生物，逐步创建组合生物合成。利用基因重组微生物提升已经有抗生素产量和有效组分含量。纤维素堆囊菌（Sorangiumcellulosum）——大环内酯类抗生素堆囊菌素，—琥苍菌素（抗真菌）第23页组合生物合成——将产生不一样抗菌药品或其它生理活性中间