流式基础原理及应用-血研所

贝克曼库尔特

流式细胞技术

刘香岚(Sunny)ProductSpecialistTelleckmanCoulterFlowCytometryProducts流式细胞术Kaluza软件操作23Result4流式细胞术原理和操作1Result4流式细胞术应用流式细胞术

流式细胞技术(Flow

Cytometry,FCM)

–研究范围：动物细胞、植物细胞、细菌、病毒、微生物、寄生虫等生物体

以及其中的DNA、蛋白或其他分子，还可以利用微球研究可溶性蛋白

0.1um>50um流式细胞术

流式细胞术定义：

在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性细胞结构细胞大小细胞粒度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞功能细胞表面/胞浆/核的特异性抗原细胞活性细胞内细胞因子酶活性激素结合位点细胞受体在上述信号基础上的细胞分选

检测特点：特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析基础医学和临床新药研究生物学领域疾病机理等细胞表型分析按照细胞的蛋白表达（或转染）定量按照细胞的DNA量的变化来分类和定量按照细胞功能改变（如分泌细胞因子，受体表达等）来对细胞进行分类和定量按照细胞生物大分子的暴露来分类细胞和定量按照特定细胞的标记对该细胞进行上述指标的深度研究细胞生物学研究细胞存活率检测细胞凋亡发生率检测细胞免疫功能改变检测细胞周期检测纳米药物和材料研究和应用纳米材料基础研究，如半导体种类、组成比例、直径大小与光谱激发纳米材料的应用，如吸收和发射性能、半衰期、标记效率、色谱交叉和补偿、标记检测等纳米材料对细胞的毒性性能检测，如凋亡、激活能力等纳米材料导入细胞的途径和效率研究流式细胞术微生物及海洋生物学研究

流式细胞仪---基本构造荧光信号—电信号—数字信号液流系统光学系统电子和计算机系统形成层流，聚焦细胞产生和收集光信号分选系统流式细胞仪---液流系统样本流鞘液流流动室:检测样本在此与激光正交由于鞘液的作用，待测细胞被限制在液流的轴线上——流体动力学聚焦流动室侧向及荧光信号前向散射光信号鞘液激光Absorptionspectrum:RangeoverwhichafluorescencecompoundmaybeexcitedEmissionspectrum:Rangeofemittedwavelengthsforaparticularcompound激光—激发光学系统滤光片—收集光学系统流式细胞仪---光学系统之激光器激光光源提供单一波长、单一方向的稳定光照375405488532561638常用激光器种类---激光波长流式细胞仪---光学系统之滤光片长通滤片（LongPassFilter）：只允许特定波长以上的光线通过（500LP）短通滤片（ShortPassFilter）：只允许特定波长以下的光线通过（500SP）带通滤片（BandPassFilter）:只允许特定波长的光线通过

（500BP500/50）二向色性滤片(DichroicFilter)：45角放置允许一定波长的光线通过，其

他光线被反射

反射光550DL>550nm<550nm488DL488BK550DL525BP600DL575BP640DL620BP675BP流式细胞仪---电子系统进行信号检测和分析荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度流式细胞仪---电子系统电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、作图、统计分析流式细胞仪---计算机系统流式细胞分析仪的工作原理样本的检测与分析---信号散射光信号

荧光信号样本的检测与分析---信号散射光信号——前向散射光：在激光束正前方的检测器所检测的光信号，主要与细胞相对大小及其表面积有关样本的检测与分析---信号散射光信号——侧向散射光：与激光束垂直方向的检测器所检测的光信号，主要与细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性有关样本的检测与分析---信号根据散射光信号，在人白细胞中鉴别出不同亚群：白细胞淋巴细胞单核细胞

粒细胞FSC样本的检测与分析---信号荧光信号FITC激光488nm519nm578nm667nmFITCPEPC5样本的检测与分析---数据数据显示:

直方图(Histogram)

二维点图(DotPlot)

等高线图(ContourPlot)

密度图(Density)等直方图分析（HistogramPlot）

横坐标表示散射光或荧光信号相对强度值，其单位是道数，可以是线性的，也可以是对数的，纵坐标表示细胞数样本的检测与分析---数据散点图分析（Dotplot）样本的检测与分析---数据1234数据分析---双参数等高图和密度图电压调节－利用同型对照：设置背景

电压volts

增益Gain设定阴性和阳性信号强度的临界点电压的调节-确定信号放大程度电压适当电压太低电压太高电压调节的原则：同型对照或阴性对照在阴性区域呈正态分布，阳性率<2%但不为0样本的检测与分析---荧光补偿荧光染料EXEM应用

荧光染料EXEM应用五光十色的荧光素样本的检测与分析---荧光补偿样本的检测与分析---荧光补偿520400500600700575665FITCPEPC5laserFITCPE14FITCPEx-meanQ1=Q3y-meanQ3=Q4123423样本的检测与分析---荧光补偿补偿前23FITCPE14FITCPENotenoughLFL2-%LFL1y-meanQ3<Q41234FITCPETooMuchLFL2-%LFL1andTooMuchLFL1-%LFL2y-meanQ3>Q4x-meanQ1<Q31234补偿不足过补偿FITCPEGOODx-meanQ1=Q3y-meanQ3=Q41234流式结果分析过程CD45RA-ECDCD27-PC5CD8-PC7CD4-PECD3-FITCSSSSFSCD45RA-ECDCD27-PC5CD4T细胞CD8T细胞通过设定图形及各群细胞的逻辑关系找到目的细胞淋巴细胞T细胞活化活化流式细胞术Kaluza软件操作23Result4流式细胞术原理和操作1Result4流式细胞术应用免疫功能监测：HIV；移植HLA配型；移植后排斥：感染；风湿免疫性疾病等免疫相关疾病肿瘤肿瘤疾病预后及手术、化疗效果评价;多药耐药p170检测血液病白血病淋巴瘤免疫分型、PNH诊断，贫血、ITP等疗效评价流式细胞术的常见应用----临床流式细胞术的常见应用----临床感染性疾病的鉴别与病情进展判断肿瘤疾病预后及手术、化疗效果评价血液系统疾病诊断和预后：白血病淋巴瘤免疫分型、

PNH诊断，贫血、ITP等疗效评价移植后排异反应监测风湿免疫性疾病辅助诊断、疗效和预后判断不孕不育、流产预警细胞治疗其他免疫相关疾病：肾小球肾炎、甲亢、糖尿病等国内常规临床流式检测项目39流式细胞术的常见应用----科研细胞周期分析细胞凋亡细胞增殖细胞因子检测机体免疫功能监测干细胞研究……细胞周期检测G0/G1SG2/M在细胞周期的不同时期，细胞中的核酸（DNA）的含量是完全不同的，因此，可以通过特异性核酸染料如PI，SYTOX-Green等，通过流式细胞仪的检测，得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出G0/G1、S期和G2/M的比列皮肤呈纤维细胞细胞周期检测细胞凋亡检测AnnexinV/PI双染法测定细胞凋亡示意图细胞增殖能力检测CFSE是一种非极性分子，可自由穿透细胞膜，并在细胞内被酯酶水解转化成具有荧光特性CFSE，它可以自发不可逆的通过共价结合赖氨酸侧链或者其他可利用的氨基而掺入细胞内和细胞表面的蛋白。当细胞分裂时，染料也均匀的分布到子代细胞中，同时结合了氨基后的CFSE能够吸收488nm的光，同时发出强的绿色荧光，这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞以荧光强度的2倍递减，流式细胞仪基于这一点从而达到分析细胞增殖的目的细胞因子检测细胞因子（白介素、干扰素、肿瘤坏死因子……）细胞因子分泌型细胞(Th1、Th2、Th17、Treg……)CBA（Cytometric

Bead

Array）通过利用一系列带有荧光标记的微小、分散的微球连接特定的捕获抗体以捕捉溶液系统中的待测物，通过对应各种不同检测物的特异微球上所带有荧光强度不同从而同时测定分析样本中多种可溶性成分的数量细胞因子检测细胞因子检测Th1细胞分泌IFN-γ；Th2细胞分泌IL-4、IL-5或IL-13；Th9细胞分泌IL-9；Th17细胞分泌IL-17；Th22分泌IL-22Treg表达Foxp3效应CD4+T细胞以往被认为只是由Th1或Th2组成，现在认识到还有Th9、Th17、Th22和Treg。这些细胞的区别在于它们分泌的细胞因子：穿孔素、和颗粒酶存在于CTL细胞和NK细胞的胞浆颗粒中，用以评价CTL和NK的杀伤活性.细胞因子检测细胞因子的流式检测流程选择合适的细胞类型，如淋巴细胞、单核细胞等选择合适的激活程序体外刺激，诱导细胞产生细胞因子激活剂包括：PMA、植物凝集素、Ionomycin和脂多糖（LPS）等在细胞激活期间加入蛋白转运抑制剂brefeldinA或monesin固定/通透细胞用特异的抗细胞因子的单克隆抗体染色流式分析细胞因子检测细胞因子检测临床流式检测的免疫学基础机体免疫功能的监测CD3+：总T细胞数量——免疫大军的数量CD4+：辅助调节性T细胞——指挥部CD8+：杀伤性T细胞——战士CD4/CD8：比例均衡Th1/Th2：活化/抑制，反馈机制——参谋Treg：负反馈——权力制约CD69：早期活化——战斗准备HLA-DR：持续活化——投入战斗NK：免疫监视——警察单核巨噬细胞、DC——情报员IMPannel表型鉴定基本方案—描绘主要淋巴细胞亚群和单