《猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范（MHC-肽四聚体）（征求意见稿）》编制说明

1江苏省地方标准《猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范（MHC-肽四聚体）》编制说明传染病。有研究表明，PRRSV感染后能够诱发机体产生体巴细胞（CTLs）是机体有效控制各种病毒感染的重要免疫细胞织相容性复合体（Majorhistocompatilitycomplex,MHC）I类分子限特异性CTL反应是机体受到病毒感染时，控制PRRSV感染的早期诊断也具有重要的意义。当前尚缺乏客细胞的一种具有重要应用价值的技术。四个MHC-肽复合物（pMHC）通过生物素蛋白连接酶（Biotin-proteinligasTCR）的结合力，借助流式细胞技术检测，具有高灵敏性和高特异性（图1）。本文件中以猪群优势等位基因型和病毒保守抗原表位肽建立检测PRRSV特异性驯化效果评估和病毒感染的早期诊断。2024年8月，江苏立华牧业股份有限公司与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范（MHC-肽四聚体2图1：MHC肽四聚体组份示意图引自/将《猪繁殖与呼吸综合征病毒细胞免疫检测技术规范（MHC-肽2024年度省地方标准项目计划，由江苏立华牧业股份有限公司制定江苏省地方标准《猪繁殖与呼吸综合征标准的各项调研、全部试验研究和验证工作通常对同源PRRSV株具有特异性，3IFN-γ+细胞相关。PRRSV特异性T细胞在感染TCR、一分子的MHCI分子及对应的特异性抗），4PEmouseanti-pigCD4+,0.2mg/），限制性内切酶NdeI和XhoI克隆到原核表达质粒pColdI中，构建重组质粒限制性内切酶NdeI和XhoI消化鉴定，可见1300bp左右大小的片段，成功获将上述鉴定阳性重组菌分别接种5mL含有氨苄青霉素（Amp+）的培养基，菌BL21(DE3)/pColdI-GP5-β2m-α和BL21(DE3)/pColdI570kD55kD40kD图2：SDS分析SLA重组菌表达M：预染中分子量蛋白标准0：BL21(DE3)/pColdI空载体诱导后全菌裂解物1：BL21(DE3)/pColdI-GP5-β2m-α诱导后全菌裂解物2：BL21(DE3)/pColdI-N-β2m-α诱导后全菌裂解物5-cagtggtggtggtggtggtgCTCGAGtttct），++600=0.533kD有明显蛋白条带（图3）。M0170kD55kD40kD35kD25kD图3：SDS分析BirA重组菌表达M：预染中分子量蛋白标准0：BL21(DE3)/pET28a空载体诱导后全菌裂解物1：BL21(DE3)/pET28a-BirA诱导后全菌裂解物同时将质粒pET28a-BirA分别与pC表达2个重组质粒的菌株BL21(DE3)/pET28a-BirA6重组菌BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-GP5-β2m-α和BL21(DE3)/pET28a-BirA/然后再经Westernblot鉴定目的70kD55kD40kD35kD25kD图4：SDS分析共转化重组菌表达M：预染中分子量蛋白标准0：BL21(DE3)/pET28a/pColdI空载体诱导后全菌裂解物1-3：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-GP5-β2m-α诱导后全菌裂解物4-6：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-N-β2m-α诱导后全菌裂解物70kD55kD40kD35kD25kD图5：Westernblot检测共转化重组菌体内靶蛋白生物化效果M：预染中分子量蛋白标准0：BL21(DE3)/pET28a/pColdI空载体诱导后全菌裂解物1-3：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-GP5-β2m-α诱导后全菌裂解物4-6：BL21(DE3)/pET28a-BirA/pColdI-N-β2m-α诱导后全菌裂解物7蛋白纯化仪，去离子水洗AB管道，洗掉系统里20%无水和bindingbuffer洗涤新柱子，直到UV280nm线水平即可。然后上蛋白样品，密buffer除去杂蛋白，UV280nm线水平即可。之后，elutionbuf有峰则收集，并将收集的样品置于冰上，UV280nm线出提高蛋白纯度，将elution洗脱蛋白透析除咪唑后再100kD70kD55kD40kD图6：SDS分析生物素化重组蛋白纯化效果M：预染中分子量蛋白标准1-2：BGP5-SLA重组蛋白；3-4：BN-SLA重组蛋白），tetramer和PE-BN-SLA-te8mouseanti-pigCD8a和PE-pSLA-tetramer（PE-BGP5-SLA-tetramer或适量（一般不超过300uL）FACS缓冲液中，尽快上机分析。单染管对照（FITCmouseanti-pigCD3+只是版本号不同，优先使用高版本号软件。首先FSC/SS然后再根据APC-CD8+/FITC-CD3+双参数获得CD3+即抗原特异CTL细胞的百分比。结果判定标准，以pSLA+-tetram选择PRRSV抗体和抗原阴性1月龄的大白猪36头，其中7PE-BN-SLA-tetramer）、1%（v/v）的APC-anti-pigCD液中，上机分析APC-anti-pigCD8a和PE-BGP5-SLA-tetra分比是对照组（未免疫组）的3.45倍（图7B），表明VR2332弱毒疫苗激发了靶向PRRSV-N表位的特异性细胞免疫反应。图8可以看到，弱毒疫苗免疫组的），BAB图7：CD3/CD8/BN-SLA-tetramer检测弱毒疫苗（VR2332）特异性的细胞免疫反应A：CD8+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比B：BN-SLA+CD8+占CD8+CD3+双阳T细胞的百分比AB图8：CD3/CD8/BGP5-SLA-tetramer检测弱毒疫苗（VR2332）特异性的细胞免疫反应A：CD8+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比B：BGP5-SLA+CD8+占CD8+CD3+双阳T细胞的百分比例出现显著下降（图9A）；CD8+T细胞比例分别于加强免疫和攻毒后均显著升高（图9B）；从而导致CD4+T细胞与CD8+T细胞的比值随着免疫和攻毒出现性靶向PRRSVN肽表位的CD8+细胞比例，即BN-SLA+CD8+比例升高有限。 ABC图9：CD3/CD4/CD8检测灭活疫苗（NADC30-like）特异性的细胞免疫反应A：CD4+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比B：CD8+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比C：CD4+CD3+双阳T细胞与CD8+CD3+双阳T细胞百分比的比值AB图10：CD3/CD8/BN-SLA+检测灭活疫苗（NADC30-like）特异性的细胞免疫反应A：CD8+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比B：BN-SLA+CD8+双阳T细胞占CD8+CD3+T细胞的百分比AB图11：CD3/CD8/BGP5-SLA+检测灭活疫苗（NADC30）特异性的细胞免疫反应A：CD8+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比B：BGP5-SLA+CD8+双阳T细胞占CD8+CD3+T细胞的百分比作为阴性对照，其余全部感染PRRSV（NA），（图12B），表明NADC30-like感染激发了靶向PRRSVN表位的特异性细胞免+CD3+），靶向PRRSVGP5表位的特异性细胞免疫反应，且与感染剂量呈正相关。AB图12：CD3/CD8/BN-SLA+检测感染NADC30-like感染后特异性的细胞免疫反应A：CD8+CD3+双阳T细胞占CD3+T细胞的百分比B：BN-SLA+CD8+双阳T细胞占CD8