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文档简介

1种子扦样、种子处理、种子DNA提取方法、扩增与测序、序凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所在rDNA基因中，5.8SrDNA和28SrDNA基因间隔序列称为内部转录间隔区2(ITS2)。5.2抗坏血酸钠），2注：EB有致癌作用，配制和使用时应戴一次性手套操作并妥善处理废液。），），5.12酚-氯仿-异戊醇（25:24:1）溶液5.1350×TAE缓冲液），3ITS2-R：5′–GACGCTTCTCCAGACTAC用TE缓冲液（5.11）分别将上述引物苦参ITS2序列长267bp，未发现变异位CACATCGTTGCCCCAATGCCTCAGCCCTGTTGCTAGGCATAGTAAAGGGGTCCCGTGAGCGATGCCTCGCGGTTGGCTGAAAATTGAGTCCGTGGTGGAGTGCGGGTGGTTGAGTAAGAGCTCGAGACCGATCGTGTGTGTCACCCCTACCGGATTTGTGACTCCCATGAGCGGCCGTTGGC苦参种子表面经无水乙醇处理后，用中药材粉碎机或研磨仪粉碎，粉碎后颗粒直径小于1mm，取a.在有100mg粉末的离心管中加入1000μL65℃预热的2%CTAB提取液（5.10），加入1μLβ-巯基乙醇，另加入少许PVP干粉，金属浴65℃保温30min），d.取上清液，加入2/3体积的－20℃预冷的异丙醇，置于－20℃30min。在4℃条件下14000r/mine.弃上清，加入300mL75%乙醇轻振荡，在4℃条件下12000r/min离心10min。弃上清，室温下静4试剂终浓度单样品体积无菌水10×PCR缓冲液2.5μLdNTPS0.6mmol/L10μmol/L上游引物0.2μmol/L0.5μL10μmol/L上游引物0.2μmol/L0.5μL5U/μLTaq酶（热启动）0.025U/μL0.12525g/LDNA模板注：10×PCR缓冲液含氯化镁，以上反应试剂按顺序添加。应用序列拼接软件进行序列拼接及校对，去除序列两端5.8S和28S基因区

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