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进出口化妆品中病原菌检测方法微滴式数字PCR法第5部分：洋葱伯克霍尔德氏菌2除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：6.1恒温培养箱：36℃±1℃。6.2冰箱：2℃~8℃、-20℃。6.3均质器或乳液分散机(转速1000rmin以上)。6.4电子天平：感量0.1g。6.5高速微量离心机(最大离心力不小于10000g)。6.6涡旋振荡仪。6.7加热装置：95℃-100℃。6.9无菌均质袋或均质杯。6.13离心管：2mL、1.5mL和0.2mL。6.14阳性对照：洋葱伯克霍尔德氏菌ATCC25416或等效菌株或含目的片段的DNA。7.1仅使用分析纯试剂和符合GB/T6682规定的一级水。所有试7.2DNA提取液：见附录A中A.1。7.3含多粘菌素B的大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SLDLP)液体培养基：见附录A中A.2。7.5生理盐水：见附录A中A37.6dAPCR反应配套试剂。7.7洋葱伯克霍尔德氏游1号染色体特异性序列片段参见附录B,引物探针如下：Primer-F:5'-cCNTiWCAAGACGTTCGPrimer-R:5'-CITCCGCGGATTCGACProbe-P:5'-FAM-TCGCCGTCCGCAAGATGCAGG-BH进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德氏菌ddPCR检验程序见图1。图1进出口化妆品中洋葱伯克霍尔德氏菌检验程序9实验操作步骤9.1样品前处理待测的样品应在室温下保存，不要温育、冷藏和冷冻样品。样品的制样处理参照SN/T5075的规定执行。9.2增菌培养吸取10mL1:10样品稀释液接种到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，置于36℃±1℃培养箱培养18h~24h。混匀增菌培养物，在其液面表层吸取1ml.于10000g-12000g离心3min,弃去上清液。必要时，用生理盐水清洗沉淀1次~2次。用1mL生理盐水混悬沉淀，于10000g~12000g离心3min,弃去上清液。在沉淀中加人50μLDNA提取液振荡混匀，于95℃~100℃加热10min,室温冷却2min后，于10000g-12000g离心5min,取上清液作为DNA模板。若不能及时分析，DNA模板可置于-20℃以下冷冻保存备用。9.4DNA浓度和纯度测定样品DNA使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定260nm和280nm处的吸收值A一水一一6主要培养基和试剂灭菌一级水将Chelex-100顺粒加入灭菌一级水中混匀，2℃~8℃保存。A.2含多粘菌素B的大豆酪蛋白卵磷脂吐温80(SCDLP)液体培养基酪蛋白胨大豆蛋白胨氯化钠磷酸氢二钾葡萄糖卵磷脂蒸馏水先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其他成分混合，加热溶解，调pH值为7.2-7.3,分装，每瓶90mL,121℃高压灭菌20min。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合。冷却至25℃左右使用。使用前，用过滤除菌方法加入多粘菌素

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