布鲁氏菌病检疫技术规范

布鲁氏菌病检疫技术规范7.2细菌培养细菌培养方法按GB/T18646执行。7.3多重聚合酶链式反应(多重PCR)7.3.1仪器和设备高速低温离心机、手掌式台式离心机、PCR扩增仪、水平电泳仪、凝胶成像分析仪、水浴锅、漩涡振荡器、可调移液器。73.2试剂和材料7.3.2.1细菌基因组DNA提取试剂盒。7.3.2.2布鲁氏菌质控菌株：猪种布鲁氏菌标准菌株或其模板DNA。7.3.2.310×Taqbuffer,dNTP混合液(2.5mmol/L,含镁离子)、TaqHS聚合商(250U,5U/μL)或其他适合的商品化的PCR试剂，5kbDNA分子质量标准(5kbDNAmarker)7.3.2.4TE缓冲液、1X电泳缓冲液(1XTBE)、GelRed或其他适合的商品化的安全无毒核酸凝胶染色试剂、10×加样缓冲液或其他适合的商品化加样缓冲液，按附录C配制。7.3.2.5琼脂糖。7.3.2.6试验用双燕水(ddH₂O):符合GB/T6682中的二级水。7.3.2.7移液器滴头：10μL、200μL、1000pL。7.3.2.8PCR反应管。73.3操作步骤7.3.3.1样品制备7.3.3.1.1标准菌株：用无菌接种环挑取单个布鲁氏菌质控菌株菌落，放入200μL无菌双蒸水。7.3.3.1.2样品：可疑布鲁氏菌培养物，用接种环挑取单个可疑菌落于200μL无菌双蒸水。7.3.3.2DNA模板的提取将7.3,3.1制备的菌悬液80℃灭活2h,按适合的基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取模板DNA,然后12000v/min离心20s,取上清液作为PCR扩增时模板DNA(DNA浓度为0.1μg/μL~PCR引物序列见表1。表1PCR引物序列ATC-CTA-TTG-COC-CGA-TAA-GCT-TCG-CAT-TTT-CAC-TGT2GCG-CAT-TCT-TCG-GTT-ATCGC-AGG-CGA-AAA-CAG-CT序列5'→3TTT-ACA-CAG-GCA-ATC-CAGCG-TCC-AGT-TGT-TGT-TG4TOG-TCG-GTG-GAC-TGG-AT5GCC-GCT-ATT-ATG-TGG-ACAAT-GAC-TTC-ACG-GTC-GTT-6GGA-ACA-CTA-CGC-CAC-CTGAT-GGA-GCA-AAC-GCT-G7CAG-GCA-AAC-CCT-CAG-GAT-GTG-GTA-ACGCAC-AC8CGC-AGACAG-TGA-CCA-GTA-TTC-AGC-COC-CGT-TA9AGA-TAC-TGG-AAC-ATA-GCC-ATA-CTC-AGG-CAG-GAT-ACC-扩增牛种布鲁氏菌疫苗株RBS1时片段大小为252.5mmol/L.dNTP温合液(含接高子)TaqDNA聚合南(5U/μL)体系中。+一+++一+5+一十一十+十一十6十一十十十十一十7++十+++65表3结果判定(续) 5 5 ++ + 左 7.4.1.2.1细菌基因组DNA提取试剂盒或组织和全血基因组DNA提取试剂盒或用于奶样基因组DNA提取试剂盒。将7.3.3.1制备的菌悬液或增菌液或阴道分泌物、全血、奶液、子宫或脾组织均质液等检疫样品80℃灭活2h,按适合的基因组DNA提取试剂盒操作说明书提取DNA,12000r/min离心20s,取上上游引物(IS117-F1);5'-CGCTCGCGCGGTG注：菌是液样品提取的模板DNA用量1.0L+检疫样品提取的模板DNA用量9引物序列S'→探针序列S'→'1FAM-CCTCGOCATGGC0OCCAA-B2FAM-TGGAACGACCTTTGCAGG3FAM-ATATGGOCGGCTATCOGOGT4FAM-TGGCCTGACGGACGCGCT5FAM-CCAOGGCTTTCGCTCCGGC-注，菌悬液样品提取的模板DNA用量1.0mL:检疫样品提取的模板DNA用量9直的偏振光强度来确定。因而，大分子比转动快的小分子发射更多的偏振光。当样品中有目标抗体8.6.4.2将25×浓缩反应缓冲液用燕馏水做1:25稀释，制备稀释的反应缓冲液避免有颗粒物，稀释8.6.4.6取20mL.血清样品加人微量板其8.6.4.8将反应板置室温(18℃~26℃)孵育3min~5min后，置荧光偏振仪(激发波长485nm,发射8.6.4.10将反应板置室温(18℃~26℃)孵育2min~3min,置荧光偏振仪上读取最终偏振值。当阳性对照的偏振值为120mP~250mP,阴性对照的偏振值为70mP~95mP时，方可进行被检样品的结果判定。若阳性对照或阴性对照的偏振值超出规定的范围，需要根据仪器手册的说明重新校结果判定计算见式(2)。△——样品的偏振值与阴性对照平均偏振值的差值，单位为毫偏振(mP);可疑样品应双份重复试验。若两次样品的△均小于10mP,判为阴性；若有一次样品的△在可疑值范围内或大于阳性值范围，判为可疑，应采用其他试验进行确证：若两次样品的△均大调pH至8.3±0.02,最后补加蒸馏水至2000mL。分别取琼脂糖1g、氯化钠10g、硼酸盐缓冲液100mL却至56℃左右，将平皿置于水平台上，在每个平皿中加入约15mL(厚约2.5mm),凝固后加盖，把平皿倒置，于4℃冷藏保存备用。反应孔现用现打，从冰箱中取出制备好的琼脂平板，待平板恢复至室温(20℃~25℃)后，用打孔器打孔，将孔中的琼脂柱用针头轻轻挑出或用真空泵吸管吸出，勿伤边缘。每个平板可打5组~用可调移液器加样，见图1加样。"G"孔加抗原，"+"孔加阳性对照血清，其他孔均加被检血清。每孔均以加满而不溢出为度。然后将琼脂板放入有湿纱布的带盖的涅盒内，置室温中感作。8.7.3.4.1于24h初判，48h终判，判定时借助观察灯或自然光源。8.7.3.4.2当阳性对照血清孔与抗原孔间形成一条清晰、致密沉淀线时，本试验成立，否则需要重新做试验。8.7.3.4.3如果被检血清孔与抗原孔间形成沉淀线，且与阳性对照血清孔和抗原孔间形成的沉淀线末端相融合，则判为阳性(见图2)。鱼◎◎◎田8.7.3.4.4如果被检血清孔与抗原孔间无沉淀线形成，但阳性对照血清孔与抗原孔间形成的沉淀线末端在被检血清孔与抗原孔间向抗原孔侧弯曲，则判为弱阳性，应重复试验，仍为弱阳性者判为阳性(见++O◎④(规范性)10mL.1mol/LTris(pH8.0),2mL0.5mol/L.Na₄EDTA(pH8.0),加水定容至1000