尼帕病毒病检疫技术规范

尼帕病毒病检疫技术规范48.3.3水平摇床。8.4病料处理8.4.1将采集的病料选取具有典型病变0.5cmx0.5cmx0.3cm大小的组织，浸入10倍体积固定液固定，7d后更换固定液，再维持一周。8.4.2将选取好的组织块放入新配的固定液中固定7d,其间更换固定液三次，并在水平摇床上不断摇荡，以提高固定液的渗透力。8.4.3将固定好的组织块放入流水中漂洗24h。8.4.4放入下列不同浓度的酒精中脱水：8.4.5放入二甲苯中透明：8.4.6浸蜡：软蜡中放置2h;硬蜡中放置4h。8.4.7将浸好蜻的组织块放入包埋框中用硬蜡包埋，4℃冷却过夜。8.4.8将石蜡块切成5μm厚的切片，用干净的载玻片贴片。8.5操作方法8.5.1脱蜡：依次将切片放入二甲苯-二甲苯-二甲苯各1min,无水乙醇-无水乙醇-70%乙醇各5min,然后用流水冲洗。8.5.2将切片置于蒸馏水中漂洗、然后浸入包含0.1%(质量浓度)胰蛋白酶的0.01molL氯化钙(用0.1molL的氢氧化钠调pH值至7.8)中，37℃放置20min,用蒸馏水冲洗。8.5.3将切片放入湿盒内用PBS漂洗5min。洗完后用吸承纸吸干组织块周围的液体，每张切片上滴加200μL3%的H₂O₂溶液，室温放置20mm,然后倒掉H₂O,放入PBS中漂洗5min。8.5.4洗完后用吸水纸吸干组织块周国的液体，向切片上滴加200pL适当稀释的兔抗尼帕病毒抗体(用包含0.1%脱脂奶粉的PBS稀释，每份样品和对照均要设立平行试验),将切片封好置于37℃孵8.5.5将切片放入PBS中综洗5min。洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加2-3滴羊抗兔降标二抗，37℃孵育20m8.5.6将切片放入PBS中漂洗5min,洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，滴加显色液，在显微镜下观察染色程度。阳性对照切片染色充分后(通常2min~5min),用蒸馏水漂洗终止反应。8.5.7将切片用PBS漂洗5min,洗完后用吸水纸吸干组织块周围的液体，放入苏木素中复染1min~3min,用蒸馏水冲洗，加入Scot's溶液，流水冲洗。蒸馏水漂洗切片，用中性封片剂封片。8.5.8显微镜观察。8.6结果判定如果镜检切片显示细胞质可见褐色/红色颗粒状着色点，细胞核呈蓝色，则判定为NiV阳性。9微量血清中和试验9.1主要试剂9.1.1细胞培养液(见附录A.3)。9.1.2细胞维持液(见附录A.3)。9.1.3细胞消化液(见附录A.2)。69.3.2.4盖上培养板，轻轻摇匀，置5%二氧化碳培养箱于37℃孵育1h。9.3.2.5取出培养板，每孔加100μLVem细胞，细胞浓度为2.4×107100μL。置5%二氧化碳培养箱37℃培养，48h用倒置显微镜进行初步判定，72h后最终判定结果。9.4.1检查各种对照试验，细胞对照正常，无CPE;阴性血清对照出现明显的CPE,表现为多个细胞发生融合，形成合胞体，最后细胞脱落、裂解；阳性血清对照无CPE,细胞不出现病变。病毒滴度验证，当实际使用病毒量在30-300TCID。范围内，说明病毒稀释浓度符合微量血清中和试验的工作浓度。被检血清对照孔不出现病变，说明被检血清无毒性反应。9.4.2在各种对照成立的情况下，检查各个被检血清的CPE。如果出现CPE,则判为阴性孔；如果不出现CPE,则判为阳性孔。以完全中和病毒感染性(即不出现CPE)的最大稀释度为该血清的中和10.1主要试剂10.1.1磷酸盐缓冲液(PBS)(见附录C.1)。10.1.2病毒抗原(参见附录D.1)。10.1.3细胞对照抗原(参见附录D.2)。10.1.4封闭液(见附录C3)。10.1.5洗涤液(见附录C.2)。10.1.6底物溶液(见附录C.4)。10.1.9阳性血清、弱阳性血清和阴性血10.3.1将病毒抗原和细胞对照抗原用PBS1:1000俗释，将稀释后的抗原加入96孔板中，1、3、5、7、9和11孔加病毒抗原。2、4、6、8、10和12孔滴加细胞对照抗原。置于37℃振荡培养1h或410.3.2倒掉孔内液体，在吸水纸上吸干，每孔加满洗涤液(PBS-T),静置1min-2min后倒掉，吸10.3.3加人封闭液，每孔100μL,置37℃振荡孵育30min。10.3.4用PBS-T洗板三次(同上)。10.3.5按照10.2.3每孔加入100μL准备好的待检血清，各缓冲液对照孔加人100μLPBS(含5%鸡血清和5%脱脂奶粉),置37℃静止1h。10.3.6用PBS-T洗板三次(同上)。10.3.7用含1%脱脂奶粉的PBS-T稀释酶标抗体。混匀后除底物对照孔外每孔加人100μL,底物对照孔加人100L含1%脱脂奶粉的PBS-T,置37℃静止1h。11.1.61.5%的琼脂糖凝胶(见附录E4)。5'-TCAGYATGTATATGAAAGATAAA5TCATCYTTAACCAT5°=TCATCYTTAACCA811.2.1PCR扩增仪。11.2.2高速台式冷冻离心机：最大离心力12000g以上。11.2.3生物安全柜。11.2.5水浴锅。11.2.6微量移液器。11.2.7组织研磨器。11.2.8电泳仪和电泳槽。11.2.9紫外凝胶成像仪。11.3操作方法11.3.1核酸提取RNA提取应在样品制备区，根据样本的种类选择合适的生物安全级别的实验室进行操作。应保证无细菌及核酸污染，实验材料和容器应经过消毒处理并一次性使用。提取TFR时应避免RNA酶污染。同时设立阳性对照和阴性对照。用Trizol提取核酸RNA的操作步骤如下(样品以组织研磨上清液为例a)在无RNA酶的15mL离心管中加入200μL上清液，后加人1mLTriml,震荡20s,室温静置b)加入200μL氧仿，颠倒混匀，室温静置10mmns12000/min离心15min。c)管内液体分为三层，取500μL上清液于离心管中，加入500μL预冷(-20℃)的异丙醇，颠倒混匀，静置10min。12000rmin离心15mim沉淀RNA.弃去所有液体(离心管在吸水纸上控干)。d)加入700μL预冷(-20℃)的75%乙醇洗涤，颠倒混匀(2-3)次。12000r/min离心10min。e)调水浴至60℃。室温下干程10ain。f)加入40μL无核酸酶水(DEPe水)。60℃金属浴中作用10min,充分融解RNA.-70℃保存或立即使用。核酸提取也可以使用毒效的商品化病毒RNA试剂盒或自动化核酸提取仪。扩增体系为25pL.依次加人以下成分：11μLddH₂0,5μL5×0meStepRT-PCRBuffer,1μLOneStepRT-PCREnzymeMix,1μLdNTPMix(10mmolLcach),1μL引物ET(10μmol/L),1μL物LREV(10μmol/L),5μL模板。扩增反应条件：48°C、30min;95℃、15min:94°℃、30s.42C、30s,68℃、Imin,共30个循环；68°℃延伸5min。LFWD2(10μmol/L),IμL引物LREV(10μmolL),2μL首次RT-PCR反应产物。扩增反应条件：95℃、5min;94℃、30s,46℃、30s,72℃、30s,共30个循环；72℃延伸11.3.4PCR产物的电泳取PCR产物5μL在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，凝胶成像系统中观察结果。911.3.5结果判定当阴性对照和空白对照首次RT-PCR反应和半套式PCR中均未扩增出DNA片段，阳性对照首次RT-PCR反应扩增出现了364bp片段、半套式PCR扩增出266bp片段时，试验成立。当待检样品首次RT-PCR反应扩增出现了364bp片段或半套式PCR扩增出266bp片段，可判为NiV核酸阳性。确证可对PCR产物进行测序，参考序列见附录F。当待检样品无扩增片段或条带大小不是364bp或266bp时，均判为NiV核酸PCR阴性。12实时反转录聚合酶链式反应12.1主要试剂12.1.1RNA提取试剂盒。12.12一步法荧光RT-PCR试剂盒(或其他等效荧光RT-PCR试剂)。12.1.3无核酸酶水(DEPC水)(见附录E.12.1.4引物探针见表2。表2引物探针5"-GGT-ATG-ART-GTT-TIT-TGT-TTT-GGT-T5°-CCC-CIT-TTG-YGA-ATT-C5"-FAM-ATC-AAA-ACA-GAG-ATG-CGA-GC-M12.1.5阳性对照、阴性对照和空白对照，同11.1.8。122仪器设备12.2.1实时荧光PCF扩增仅。12.2.2高速台式冷深离心机：最大离心力12000g以上。12.2.3生物安全柜。12.2.6微量移液器。12.2.7组织研磨器。12.3操作方法123.1核酸提取同11.3.1。12.3.2反应体系的配置扩增体系为25μL,依次加入以下成分：2×RT-PCR反应液12.5μL,RT-PCR酶混合液0.25μL,NiVL11908F(20μmol/L)1.25μL,NiVL11962R(20μmol/L)1.25μ1.25μL,模板5μL,用ddH₂O补足每次进行实时荧光PCR扩增时均设阳性、阴性及空白对照。5FAM-TCCCAGGATTCTTCGCAACCATCA521探针(10μmnlL)一2ddH₂O(无菌水)一7一1分钟1注：不同数字RT-PCR试剂和仪器可根据说明书对除退火根据数字PCR结果中阴性分割体系的终点荧光值设定荧光的阈值限。阈值限需要对阴性和阳性扩增结果进行明显的区分。根据公式(3)计算回收率：式中：B(%)——回收率，即PC物质的回收率。Cm—PC物质的浓度，即稀释后的RNA模板中PC物质检测目的片段的拷贝浓度，由PC物质的数字PCR检测值乘以数字PCR反应体系的体积后，除以数字PCR反应体系中RNA模板的体积计算得出，单位为拷贝每微升。A—RNA模板的稀释倍数。V₁——提取后的RNA模板的体积，单位为微升。C。—添加到样品中的PC物质的原始浓度，单位为拷贝每微升。V₂—潍加到样品中的PC物质的体积，单位为升。每个反应孔的有效微小体系总数量不低于数字PCR系统理论数的60%;阳性对照或阳性样品的阳性微小体系数量低于总体系数量的80%。阴性对照组和空白对照组内均没有任何扩增现象；PC对照的回收率>1%。有一项不符合则实验重斯进行。本文件数字PCR法所能达到的检测限：NiV750拷贝/g(组织)。本文件数字PCR法所能达到的定量限：NiV100拷贝每个样品设置3组平行反应，若样品反应孔无特异性荧光信号，则认为待测样品中不含有NiV,若样品反应孔有明显特异性荧光信号，则按公式(4)计算相对标准偏差：式中：X₁,X₂,X₁——分别为三个平行组的检测值。X——三个平行组的平均检测值。三个平行检测值的相对标准偏差(RSD)≤25%时，其平均值乘以数字P…病毒分离和微量血清中和试验培养基和试剂的配制A.1抗生素贮存液用灭菌三蒸水配成每毫升含100001U青霉素和10mg链霉素的抗生素贮存液，用微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装成2mL/瓶，-20℃冻存备用。保存期不超过60天。A2细胞消化液(0.02%EDTA)EDTA(乙二胺四乙酸二钠)氯化钠氯化钾磷酸氢二钠磷酸二氢钾加三蒸水至1000mL,充分溶解，分装成小瓶，115℃高压灾菌10mm,4℃冷藏备用。保存期不A.3细胞培养液和细胞雄持液灭能的无菌胎牛血清(FBS):56930min灭能的无菌胎牛血清。细胞培养液：含10%灭能的无菌胎牛血清(FBS)的EMEM培养基。细胞维持液：含2%灭能的无菌胎牛血清(FBS)的EMEM培养基。细胞培养液和细胞维持液均用微孔滤膜(0.22μm)过滤除菌，分装成小瓶，4℃保存备用。保存期不超过60天。使用加1%抗生素贮存液(终浓度为每毫升EMEM培养基含100U和100μg)。并用7.5%碳酸氢钠溶液调盒值至7.0-7.2。(规范性)酶联免疫吸附试验抗原制备与样品前处理D.1病毒抗原制备D.1.1在滚瓶中培养Vero细胞直至合流，每瓶保留5mL培养液，其余倒掉。在P4实验室条件下将NiV病毒接种到Vemo细胞。D.1.233℃旋转滚瓶30min以吸附病毒。然后每瓶加60mL细胞培养液。33℃继续旋转48h。D.1.3用预冷的0.01mol/LPBS洗涤病毒感染的细胞一次，每瓶刮取细胞，收集到5mL~10mL预冷的D.1.4将收集的细胞转移至50mL离mmol/LTris,10mmolL,1.510mmolLMgCl₂,pH7.2)重悬细胞，每瓶大约0.5mLTNM。D.1.5加NP40裂解液至1%,用移液器吹打5-10次以裂解细胞。D.1.7轻轻地将上