实验二 电泳课件

实验二电泳

兰州大学生命学院沈喜2012.5第二部分免疫印迹分析实验二电泳一、实验原理

人类免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）根据其重链稳定区的分子结构和抗原特异性的不同，分为五类：IgG、IgA、IgM、IgD、IgE。其中IgG占血清免疫球蛋白总量的70%～75%。

大多数抗菌性、抗毒性和抗病毒抗体属于IgG，它在抗感染中是主力军。患变态反应性疾病、自身免疫性疾病、各种感染以及多发性骨髓瘤等时，免疫球蛋白可异常增高。患获得性免疫缺陷综合征等免疫缺损病时免疫球蛋白可异常降低，临床上常应用免疫球蛋白制剂防治传染病、某些肿瘤和免疫缺损病等。

实验二电泳

人的IgG由两条重链（heavychain,H链）和两条轻链（lightchain,L链）组成，H和L链上有可变区（variableregion,V区）和恒定区（constantregion,C区），它们之间以二硫键相连。在加SDS的电泳条件下，分子中的二硫键被还原成游离的巯基，四条链分开，重链迁移速度较慢，轻链迁移速度较快，可跑出两条带。实验二电泳特异性抗体检测相应抗原条带

酶标二抗第一抗体被测抗原封闭物

电泳分离的蛋白质转印到硝酸纤维素膜上，不同的几何形状代表不同种类的蛋白质。一抗(兔抗人IgG

)识别人IgG重链并与其结合，再用过氧化物酶标记的二抗(羊抗兔IgG

)与一抗结合，最后加入过氧化物酶的底物，酶催化底物产生有色、不溶性的产物，沉积在人IgG的重链带上。根据颜色的深浅和面积，可以估计被测蛋白的量。实验二电泳信号放大作用间接检测法：

二级抗体可测定多种多样的一级抗体从而避免了逐一标记一级抗体;

一抗通常能与几个二抗分子结合，从而起了信号放大的作用。Western印迹法检测蛋白的敏感性为1-5ng。缺点：是一抗可能会与二抗发生交叉反应，产生非特异性条带；检测过程增加了额外的温育步骤。实验二电泳二、实验目的通过蛋白质标准曲线求出IgG重链的分子量检测人体患病状态下IgG蛋白含量的差异实验二电泳两个胶条分别处理宽胶条考马斯亮蓝R250染色窄胶条转印后免疫染色人血清标准蛋白人血清

三、实验步骤实验二电泳染色、脱色

将宽胶条放到培养皿中，用蒸馏水清洗后，加入约10ml考马斯亮蓝R-250染色液染色1小时左右，然后换成脱色液脱色，不时摇动。更换几次脱色液，至背景无色透明，条带清晰为止。实验二电泳

制备“转移三明治”1.切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液或水浸泡5min使之湿润。2.准备2张滤纸和海绵一起浸泡在转移缓冲液中。3.打开转移槽的胶板，依次放入：

a.一张浸湿的海绵。

b.一张浸湿的滤纸。

c.用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的气泡。

d.硝酸纤维素膜，在膜的右下角剪一小角，以标明电泳方向。

e.一张浸湿的滤纸。

f.一张浸湿的海绵。实验二电泳转移电泳槽的夹板实验二电泳转移.

小心地合上胶板，按胶侧为负极，膜侧为正极的方向放入转移电泳槽中，加转移缓冲液至满。实验二电泳转移电泳装置

插好电极，打开电泳仪开关调至稳压60V，电泳1h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。目标蛋白质越大，时间越长

实验二电泳膜的酶联免疫染色1、封闭：用TBS缓冲液洗膜1min后，将膜封入塑料薄膜袋内，留一开口。加封闭液1ml(0.2ml/cm2)后封闭开口，37℃摇床上摇动30-50min。实验二电泳封口机的操作加热指示灯加热时间调节旋钮实验二电泳加封闭液及抗体2、与第一抗体结合(1)弃封闭液，加入适当稀释的1ml第一抗体溶液(兔抗人IgG)，封口后37℃摇床上轻轻摇动50min。(2)取出膜，用TTBS洗膜3次，每次1min。再封入一新的塑料薄膜袋内。实验二电泳加入封闭液后的塑料袋实验二电泳一抗反应二抗反应3、与酶标第二抗体结合(1)加入适当稀释的1ml辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，37℃摇床上轻轻摇动50min。(2)取出膜，用TTBS洗3次，每次1min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。实验二电泳

4、加底物溶液显色

将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，用水清洗，以除去多余的底物。转入水中保存。实验二电泳

四、结果分析

在凝胶成像分析系统上照相，并分析结果。测量分子量标准蛋白的迁移距离，作出标准曲线，再测出硝酸纤维素膜上的人IgG条带的迁移距离，在标准曲线上查出人IgG重链的分子量。实验二电泳凝胶成像分析系统

实验二电泳四、需配制的试剂1、TBS（Tris-HCl,NaCl）缓冲液：20mmol/LTris-HCl,500mmol/LNaCl，pH7.5，每组配200ml。2、TTBS：取100mlTBS，加250μl20%Tween-20。3、封闭液及抗体稀释液：1％脱脂奶粉-TBS，每组配10ml。4、底物溶液：2.5mg二氨基联苯胺（DAB）+10mlTBS+

10μlH2O2，临用前配制。 (由一组同学统一配制)6、脱色液：终浓度：乙醇30%，冰乙酸10%，余为水，配70ml5、考马斯亮蓝R250染色液：考马斯亮蓝R2500.01g，溶于20ml脱色液中。实验二电泳思考题1、请用自己的标准曲线求出IgG重链的分子量。2、12%的分离