6-分子生物学研究方法

分子生物学研究方法（下）

——基因功能研究技术

酵母菌是单细胞真核生物，具有和动、植物细胞相似的结构特征。其细胞生长发育过程和动、植物细胞也有很高的相似性，很多基因在酵母、植物细胞中高度保守。酵母细胞很容易进行生物化学和分子生物学操作酵母-基因功能研究中的模式生物

酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早完成基因组DNA全序列测定的真核生物。鉴于其快速生长能力、无性繁殖能力以及简便的平板影印能力，它是生命科学领域里广泛应用的模式生物之一。导入酵母细胞中的DNA即能以自主复制的分子形式存在，也可被整合到基因组的方式存在。酵母中转化DNA的整合重组主要通过同源重组方式进行，整合效率较高。

酵母的遗传学和分子生物学简介酵母单倍体和二倍体的重大差异：细胞直径大约5μm。出芽方式生长。酵母单倍体和二倍体的重大差异：二倍体细胞直径大约是单倍体的1.3倍。二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体通常接近圆形。二倍体细胞按极性方向出芽，单倍体按轴线方向出芽。

酵母细胞有三种交配型：单倍体MATa；MATα二倍体MATa/αMATa与MATα交配形成MATa/αMATa/α不能与MATa或MATα交配

二倍体酵母细胞在营养缺乏（低氮、无发酵性碳源）的条件下能通过减数分裂形成单倍体的孢子。从单个孢子来源的所有细胞都带有一套相同的染色体DNA。以酵母亮氨酸合成基因为例二倍体通过减数分裂形成单倍体细胞的过程生活史：指上一代生物个体经一系列生长，发育阶段而产生下一代个体的全部过程以酿酒酵母为代表：营养体既能以单倍体也能以二倍体形式存在子囊孢子（n在合适条件下）——单倍体营养细胞（n）——出芽生殖（n）——两个性别不同的营养细胞彼此结合形成二倍体营养细胞（2n）——出芽生殖（2n）——变为子囊（在以醋酸盐为唯一或主要碳源，缺乏氮源即产孢子培养基上）——减数分裂——4个子囊孢子（用蜗牛消化酶破壁可释放其中的子囊孢子）利用整合型质粒(Yip)可以对酵母基因组中的任意基因进行精确的敲除(置换)，并通过孢子繁殖中的四分体分析技术进行观察和研究。带有致死位点和可能的外源功能互补基因的酵母二倍体细胞在饥饿条件下形成四分体孢子，含有突变基因的单倍体可以存活，否则就不能存活。酵母基因置换包括一步置换法和两步置换法酵母基因转化与性状互补同源重组一步置换法：置换一步置换法：筛选两步置换法：第一步第一步：在目标位点插入含突变等位基因的质粒--产生这一基因区段的重复，一个为野生型，一个为突变型两步置换法：第二步第二步：两个基本重复拷贝之间随即发生同源双交换，导致质粒DNA的切除和重复区段中一个拷贝的丢失将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化或分析细胞中化学成分的变化即可推测该基因的生物学功能e.gw-6脂肪酸脱氢酶的基因外源基因在酵母中的功能鉴定

凝胶滞缓试验（gelretardationassay），又叫作DNA迁移率变动试验（DNAmobilitshiftassay），是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。原理：蛋白质与DNA结合后将大大增加分子量，在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。凝胶滞缓实验EMSA凝胶滞缓(EMSA)技术是用于体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。基本原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果DNA分子与某种蛋白质相结合，导致分子量增大，在凝胶中的迁移作用受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。步骤：用放射性同位素标记待测的DNA片段探针DNA与细胞提取物共温育，形成DNA-蛋白质复合物复合物加到非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳若提取物中不含有与探针DNA作用的蛋白质，则放射性标记出现在凝胶的底部；否则出现在凝胶的不同位置步骤示意图拟南芥转录因子At5g11590与不同DNA元件有不同的结合能力。结果噬菌体是细菌病毒的总称，有“吞噬”之意。烈性噬菌体：在溶菌周期，噬菌体将其感染的宿主细胞转变成为噬菌体的“制造厂”，产生出大量的子代噬菌体颗粒。温和噬菌体：溶源生长周期是指噬菌体DNA被整合到宿主细胞染色体DNA上，成为它的一个组成部分，感染过程中不产生子代噬菌体颗粒。噬菌体展示技术概念：将基因表达产物与亲和选择相结合的技术。原理：将编码“诱饵”蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，并使之与噬菌体外壳蛋白编码基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵”相互作用的蛋白质。原理示意图应用既可以筛选与给定杂合子外壳噬菌体作用的蛋白质（靶蛋白）又可以筛选与给定靶蛋白作用的噬菌体亲和筛选法直接法：靶蛋白固定在固相支持上，不同的噬菌体与之温育，洗去未结合的噬菌体间接法：将生物素标记的靶蛋白与噬菌体温浴，之后铺到含有链霉亲和素的培养皿中，洗去未结合的噬菌体，保留在平皿上的就是结合状态的噬菌体亲和筛选示意图：左为直接法，右为间接法细胞的生长发育、周期调控、基因表达、蛋白质合成以及神经功能、肌肉收缩等都离不开蛋白质特异性磷酸化，因此，由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白可逆磷酸化过程，是生物体内一种普遍且重要的调节方式，控制着众多的生理生化反应和生物学过程。蛋白质磷酸化分析技术由于细胞内可能有多达上千个蛋白激酶，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难，科学家常用体外激酶活性分析法来检测蛋白激酶活性。该方法能十分可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。蛋白质磷酸化技术蛋白激酶底物蛋白发生磷酸化蛋白质磷酸酯酶底物蛋白发生去磷酸化ATP或GTPγ磷酸基团转移到底物蛋白磷酸化与去磷酸化蛋白质磷酸化研究方法（电泳法）底物蛋白待检测的蛋白激酶上样电泳聚合到SDS-聚丙烯酰胺凝胶凝胶洗去SDS使蛋白质复性加γ-32P-ATP反应液孵育12h后三氯乙酸终止反应放射自显影检测32P标记的γ集团结合的底物蛋白真核表达系统比较体外重组蛋白表达系统主要分为真核表达系统和原核表达系统。其中原核表达系统以大肠杆菌表达为主，也是目前应用最广泛最多的表达系统。真核表达系统分为：哺乳动物细胞表达，酵母表达系统和昆虫表达系统。其中哺乳动物细胞表达又分为哺乳动物细胞瞬时转染表达和稳定细胞系构建，重组抗体生产。酵母系统又分为毕赤酵母表达和酿酒酵母表达。针对真核表达系统来说，哺乳动物细胞和酵母表达较为常用。针对其各自的优缺点，如下：表达系统系统优缺点系统蛋白表达方式优点缺点真核表达系统哺乳动物细胞表达的蛋白活性高，能够表达多复杂修饰的蛋白；需要细胞房，无菌，成本投入高瞬时转染能够快速灵活的制备活性蛋白蛋白表达量低，大量生产成本极高细胞株筛选困难且时间长，投入大筛选出的细胞株能够实验蛋白的大量生产稳定细胞系构建重组抗体表达比普通单抗生产量有保证需筛选细胞株，需耗时耗力酵母表达系统与哺乳动物相比只能表达简单修饰的蛋白毕赤酵母表达甲醇诱导操作方面需要时间酿酒酵母表达不常用不常用原核蛋白表达系统大肠杆菌表达操作简单。表达量高；易形成包涵体，蛋白活性无法保证蛋白质免疫印迹(Westernblotting)印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称Southern印迹法后来对RNA的印迹分析称Northern印迹法对单向电泳后蛋白质的印迹分析称Western印迹法对双向电泳后蛋白质的印迹分析称Eastern印迹法1)蛋白质免疫印迹(Westernblotting)蛋白质免疫印迹与抗体制备蛋白质免疫印迹的基本原理：将通过PAGE分离的蛋白质转移到NC膜或PVDF膜上。然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应。洗涤去除没有结合的特异性抗体后。加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体。加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。蛋白质免疫印迹的基本步骤：固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。一抗杂交：初级抗体(第一抗体)是特异性的。二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。2)抗体制备利用抗原刺激机体，使其产生免疫反应，由机体的浆细胞合成并分泌能与抗原特异结合的一组免疫球蛋白，称为抗体。用单一抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞克隆接受该抗原所产生的抗体称为单克隆抗体。由多种抗原决定簇产生的一组针对各个抗原决定簇的混合抗体称为多克隆抗体。抗体制备过程：①准备抗原，②选择动物，③动物免疫，④效价检测，⑤采集血清、纯化抗体，⑥对于抗体进行纯度及特异性鉴定。真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。蛋白质在细胞内的定位是分子生物学研究的重要话题。常用的定位方法是免疫荧光法和荧光蛋白标记法。绿色荧光蛋白(GFP)由238个氨基酸残基组成，最大吸收峰为395nm(紫外)，并有一个479nm的副峰(蓝光)；发射光谱最大峰值为509nm(绿光)。GFP的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，构成其生色团的核心。细胞定位及染色技术GRP78抗体MMP26-GFPMergeMMP26与GRP78细胞内共定位免疫荧光化学：利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学发光对其进行定位、定性及定量的研究。GRP78与MMP26在Hela细胞中的定位从实验结果可以看到PES1蛋白定位在细胞的核仁位置。高倍镜观察PES1蛋白