松材线虫病检验鉴定技术规程

1松材线虫病检验鉴定技术规程本标准规定了松材线虫病取样、检验鉴定、样品监管、检验鉴定结果反馈及疫情上报的相关技术和流程。本标准适用于松材线虫寄主植物及其制品检验鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T23476GB/T23478GB/T35342松材线虫病检疫技术规程松材线虫普查监测技术规程松材线虫分子检测鉴定技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本标准3.1松材线虫Bursaphelenchusxylophilus（SteinererBuhrer）Nickle属于线虫门（Nematoda侧尾腺纲（Secernentea滑刃目（Aphelenchida滑刃总科（Aphelenchoidoidea），滑刃科（Aphelenchoidoidae），伞滑亚科（Bursaphelenchinae），伞滑刃属（Bursaphelenchus）。其形态特征参见附录A。3.2松材线虫病由松材线虫寄生在松树体内引起松树迅速死亡的一种毁灭性林木病害，又称松树萎蔫病、松材线虫萎蔫病、松树枯萎病。3.3松木及其制品松科原木、锯材和用于承载、包装、铺垫、支撑、加固货物的木质材料。如电缆盘、光缆盘、木板箱、木托盘、垫木、枕木、衬木等。经人工合成或经加热、加压等深度加工的包装木质材料除外，如胶合板、纤维板等。3.42检验鉴定对松科植物及其制品，通过形态学特征或分子省物学特性检验判定是否含有松材线虫的过程。3.5样品从表现出异常症状的松科植物或松木制品上选取的，用于松材线虫病检验鉴定的材料。4取样4.1感病松树现地取样方法适用于春秋季普查和日常监测中发现的异常松树。春季普查在4月-6月份，秋季普查在8月-11月份。具体取样方法参见附录B.2。4.1.1感病松树典型症状感病松树在新发生林分内呈零星点状分布，多为林分中的优势木，后发展为以定居点为中心，随机向外扩散。远看松针颜色为褐色或亮红褐色，枯死枝条从树冠向下逐渐增多，针叶不脱落。4.1.2感病松树病症表现时间当年染病的松树一般在8月下旬至11月上旬表现病症，越年死亡的一般在4月-6月表现病症。4.2松木及其制品取样方法直接观察或借助锯、斧等工具检查松木及制品是否干枯；重量是否明显减轻；木质部是否有蓝变；松脂味是否消失；有无媒介昆虫危害、补充营养取食的痕迹，如侵入孔、蛀道、蛹室等。取样对象、取样部位和数量参见附录B.3。5形态学鉴定5.1分离采用贝尔曼漏斗法、浅盘法进行（参见附录C）。分离时间一般需要4h-12h。将分离液体收集到试管或者烧杯中，通过自然沉淀或使用离心机处理后得到线虫分离液。5.2镜检将盛有线虫分离液的培养皿置于解剖镜下观察，先确认有无线虫。对有线虫的样品进行活体检验，观察它的一般形态结构，选出特征明显的成虫，用胶头吸管或移液枪移至载玻片上热杀死并制作临时玻片，再根据形态特征予以鉴别。（参见附录D）5.3培养当分离的线虫为幼虫或雌、雄成虫数量极少时，可以采用疫木保温保湿或真菌活体培养法快速培养松材线虫。（参见附录D）5.4形态特征3根据松材线虫的形态特征、松材线虫和拟松材线虫形态特征主要区别（参见附录E）进行鉴定，一般先观察线虫中的食道球形状、口针有无及口针的形状，再对其典型形态特征观察和测计后才能确定。5.5检验记录检验鉴定结果填入《松材线虫形态学检验鉴定记录表》（参见附录F）。6分子生物学鉴定常用的分子生物学鉴定方法有松材线虫PCR检测、松材线虫自动化分子检测和实时荧光PCR检测。（参见附录G）7样品监管7.1样品保存送检样品应及时做分离检测，分别保存，避免交叉污染。将样品装入塑料袋内，在袋上扎少量小孔（木段或圆盘可直接保存），保持样品湿润。标明样品信息（送检单位、样品编号、送检时间等）放入4℃恒温箱，一般在1个月内完成分离检验。检验鉴定的样品保存不少于6个月，以备复检。7.2分子生物学检验样品送检样品送检时有条件的要先经过初步镜检，镜检后出具初步检验鉴定报告和松材线虫形态学检验鉴定记录表，并填写松材线虫分子生物学检验送检表（附录H），报送省级检验鉴定机构登记检验。送检要有专人负责，保证样品送检安全，不能通过邮寄方式。7.3样品销毁分离检验后的样品要采用高压灭菌、焚烧、粉碎的方式及时销毁处理。8检验鉴定结果反馈及疫情上报8.1检验鉴定结果反馈省级检验鉴定机构应当在收到送检样品10个工作日内出具检验鉴定报告报告样式参见附录I）并留档备查。8.2检验鉴定结果确认检验鉴定结果可能为新增松材线虫病疫区和疫点时，省级检验鉴定机构应当在检验鉴定后3个工作日内，将结果报送至省林业和草原行政主管部门所属的防治检疫机构，由其组织相关检验鉴定机构进行二次确认，确认后反馈至送检单位。8.3检验鉴定备案省级检验鉴定机构每半年需将检验鉴定开展情况上报省林业和草原行政主管部门所属的防治检疫机构备案。市、县送检的检验鉴定记录、报告等档案要保存3年以上。48.4疫情上报松材线虫病疫情一经确认，市、县林业和草原行政主管部门应在规定时间内同时报告上级林业和草原行政主管部门及当地人民政府。8.5疫情信息发布国家和省级林业和草原行政主管部门按照有关规定发布疫情信息。5松材线虫形态特征松材线虫的雌、雄虫都呈蠕虫形，虫体细长。唇区高，缢缩明显，前缘圆。口针细长，中食道球卵圆形，占体宽的2/3以上。雌虫阴门宽，上阴唇长，向下覆盖。尾部末端近圆柱形，尾端椭圆或尾尖突，尾尖突长1μm左右，不超过2μm。雄虫交合刺大，呈弓形，成对，交合刺末端膨大尖突。尾部末端尖，侧面向腹弯曲呈爪状，端部包裹卵形交合伞。雌虫：A.整体；F.体前部；G.阴门区；H-J.尾部雄虫：B.整体；C.尾部；D.尾端；E.交合刺6松材线虫病取样B.1取样工具电锯或手锯、砍刀或斧头、手摇钻、标签、塑封袋。B.2现地取样方法B.2.1取样对象优先抽取尚未完全枯死或刚枯死的松树。可参照以下特征选择取样松树：（1）对发现的枯死、濒死松树首先排除其它死亡原因（干旱、人畜破坏、森林火灾、冻害、水渍、其它病虫危害）；（2）针叶呈现红褐色、黄褐色；（3）整株或部分枝条萎蔫、枯死，但针叶下垂、不脱落；（4）树干部有媒介昆虫的产卵刻槽或侵入孔；（5）树干部松脂渗出少或无松脂渗出。B.2.2取样数量以小班为单位，表现有取样特征的松树在10株以下全部取样；10株以上的先抽取10株进行取样检验，如果检验有则不需要继续取样，如果没有要继续取样检验，直至全部取样检验为止。B.2.3取样部位优先在表现症状明显的枝条上取样。对树干取样时，一般在树干下部（胸高部位）、中部（上、下部之间）、上部（主干与主侧枝交界处）3个部位取样。对于仅部分枝条表现症状的，在其表现症状的枝条上取样。对于树干内发现媒介昆虫蛹的，优先在蛹室周围取样。B.2.4取样方法在取样部位剥净树皮，用砍刀或斧头直接砍取100g-200g木片；或剥净树皮，用手摇钻从木质部表面至髓心钻取100g-200g木屑；或者将枯死松树伐倒，在取样部位分别截取2cm厚的圆盘等。B.2.5样品标记所取样品要及时贴上标签，标明样品编号、取样地点、林班、小班、树种、树龄、取样部位、取样时间和取样人等信息。B.3松木及其制品取样方法B.3.1取样对象7选择截面无松脂痕迹、密度明显减轻或木质部有蓝变现象及有天牛危害的蛀道、蛹室的松木及其制品进行取样。B.3.2取样部位和数量原木取样时在取样部位剥净树皮，直接砍取100g-200g木片；或用手摇钻从木质部至髓心钻取100g-200g木屑；或分别截取2cm厚的圆盘。松木制品进行取样时可直接砍取100g-200g木片；或直接带回部分松木制品。B.3.3样品标记所取样品要及时贴上标签，标明样品编号、取样地点、松木制品名称、取样时间和取样人等信息。8常用的松材线虫分离方法C.1贝尔曼漏斗法贝尔曼漏斗法是分离线虫的经典方法之一。分离器由漏斗、橡皮管、止水夹、厚面巾纸组成。(图在口径为10cm-20cm的漏斗末端接一段10cm长橡皮管，在橡皮管后端用止水夹夹紧，在漏斗内铺两层大小适中的面巾纸。将样品去皮后劈成长约1cm-4cm，直径1cm-3cm的细条或直接取木屑约10g置于漏斗中的面巾纸，用面巾纸包好，加水至浸没样品。注入水后要注意使水充满漏斗和下面的橡皮管，橡皮管内不得有气泡，如果有气泡可以松开止水夹放出一些水，冲掉气泡。室温不低于20℃,分离浸泡用的水温在20℃-30℃之间，线虫游离出一定数量后可镜检，一般需要3h-12h。要轻轻打开止水夹，用培养皿或烧杯在橡皮管下接取分离液约10ml；或用离心沉淀管接取分离液5ml，自然沉淀30min或1500/min离心2min。C.2浅盘法浅盘分离器主要由浅盘和筛盘组成，其中口径略小的底部为网筛状，放在另一个浅盘里面。将两层湿纱布铺于筛盘上，把样品劈碎（或木屑）置于筛盘的纱布上，慢慢注入清水，没过样品。12h-24h后，将下面浅盘的分离液收集到小烧杯中，自然沉淀30min或1500r/min离心2min。(图C.2)图C.1贝尔曼漏斗法装置图图C.2浅盘法装置图临时玻片制作和线虫快速培养D.1临时玻片制作D.1.1杀死线虫将线虫分离液取一滴放在载玻片上，将载玻片在酒精灯火焰上来回移动5s-6s，加热过度会破坏线虫体内器官或使其表皮熟化变白，影响观察。也可以将线虫分离液放在试管中，把试管放在60℃-65℃的水浴箱中2min-3min，即可杀死线虫。D.1.2玻片制作在载玻片上滴一滴水，用挑针或吸管吸一滴线虫悬液在载玻片上，用挑针将线虫轻轻按到水滴底部，以免盖盖玻片时线虫会随水流到盖玻片的边缘，影响观察。在盖盖玻片时，要从侧面慢放，尽量不产生气泡。D.2线虫快速培养D.2.1疫木保温保湿培养将样品锯成小段，置于烧杯中，加少量清水使木段下端浸在水中，木段上端用湿纱布覆盖，在26℃-30℃培养箱内培养3天，倒取杯中水液，可获得较多成虫。D.2.2单异活体培养制备马铃薯-葡萄糖-琼脂（PDA）培养基平板。通常用于培养松材线虫的真菌为灰葡萄孢（Botrytiscinerea)或盘多毛孢（Pestalotiaspp.)，此外用镰刀孢（Fusariµmspp.)培养松材线虫效果亦佳。无菌条件下将盘多毛孢、镰刀孢或灰葡萄孢接种在PDA平板上，盘多毛孢或镰刀孢28℃恒温培养4d-5d，灰葡萄孢25℃恒温培养4-5天，待菌丝长满平板，培养完成后可长期置于4℃冰箱冷藏备用。培养基放置室温后将线虫接到菌丝上，盘多毛孢、镰刀孢在30℃条件下保湿培养线虫，2天即可分离鉴定。灰葡萄孢在25℃恒温培养线虫需要1d-3d。松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别E.1松材线虫典型形态特征图E.1松材线虫典型形态特征前体部特征雄虫尾部弓形雄虫尾部交合伞雌虫尾部指形雌虫尾部短尾尖突雌虫阴门E.2松材线虫与拟松材线虫形态特征的主要区别拟松材线虫B.muctonatus（MamiyaetEnda）在形态学和生物学方面都与松材线虫相似，但分布较松材线虫广泛，在松材线虫病的检验中常常可见，二者在形态上的主要区别在于：(表E.1)表E.1松材线虫和拟松材线虫形态特征主要区别类别松材线虫拟松材线虫雌虫尾部亚圆锥形末端钝圆，少数可见微小的尾尖突，不超过2µm，一般为1µm圆锥形，末端有明显的尾尖突，长度在3.5µm-5µm雄虫尾部交合刺远端有盘状突，交合伞为卵形交合刺远端无盘状突，交合伞为近方形松材线虫形态学检验鉴定记录表表F.1松材线虫形态学检验鉴定记录表检验单位：日期：样号采样地点天牛栖居痕迹线虫松材线虫检验日期检验人分子生物学鉴定G.1松材线虫PCR检测G.1.1线虫基因组DNA的提取制作线虫裂解液(200mmol/LTris-HC1、200mmol/LNaC1、100mmol/LEDTA、2%SDS、2%β-mercaptoethanol、200μg/mL蛋白酶K)，预冷线虫裂解液，按照10μL线虫裂解液：1条线虫比例，将线虫与裂解液置于离心管中。置于PCR仪，70℃条件下保温处理35min，在95℃条件下保温处理10min后，12000/min离心2min，取上清液。G.1.2反应体系每反应的混合液总体积为20μL，其中：（1）2.0μL10×快速TaqPCR缓冲液；（2）2μL2.5mmol/L的dNTP；（3）0.3μL快速扩增Taq酶；（4）1.5μL10mmol/L的引物组合B；（5）2.0μL的模板DNA；（6）补充高压灭菌重蒸水至20μL。G.1.3反应程序反应混合液在98℃预变性5s，进入循环98℃变性3s，52℃退火3s，72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃延伸2min。G.1.4结果检测PCR扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，电泳缓冲液为1×TAE或1×TBE，电压为5V/cm，电泳时间为30min。置凝胶于302nm透射紫外灯上观察，拍照。结果参见图G.1。图G.1松材线虫电泳检测图谱注：泳道M-标准DNA；47-49松材线虫G.2松材线虫自动化分子检测G.2.1松材线虫病试剂盒组成成分名称数量DNA提取试剂A液2ml/管×1管松材线虫裂解缓冲液DNA提取试剂B液200µl/管×1管松材线虫消化酶pCR扩增混合K液500µl/管×1管含TaqDNA聚合酶，dNTP的溶液PCR扩增混合P液150µl/管×1管特异性引物、探针线虫DNA阳性质控Y液75µl/管×1管松材线虫DNA片段阴性质控C液1ml/管×1管无酶水G.2.2适用设备松材线虫自动化分子检测系统48，松材线虫自动化分子检测系统48A，松材线虫自动化分子检测系统mini等松材线虫荧光定量PCR检测系统。G.2.3检测方法将分离的线虫置于1.5mL悬浮液离心浓缩，取底部40min，95℃,10min；12000r/min离心3min，取上清液（线虫DNA溶液）。G.2.4反应体系样品：线虫DNA溶液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。阳性对照：线虫DNA阳性质控Y液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。阴性对照：阴性质控C液3.5μL，加入K液5μL，P液1.5μL。G.2.5反应程序将样品、阳性对照及阴性对照放入机器，选择仪器中松材线虫自动检测程序。G.2.6反应结果松材线虫自动化分子检测系统采用自动程序判读检测结果，如表G.1、G.2。表G.1松材线虫自动化分子检测结果序号颜色组别样品来源Ct值判定结果11A125.83含松材线虫21A220.23含松材线虫31A328.47含松材线虫41A423.19含松材线虫51A527.38含松材线虫61A621.28含松材线虫71阳