（高清版）DB37∕T 3086-2017 猪附红细胞体PCR检测技术　　

ICS65.020.30DB37DB37/T3086—20172017-12-29发布2018-01-29实施IDB37/T3086—2017本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由山东省畜牧兽医局提出。本标准由山东省畜牧业标准化技术委员会归口。本标准主要起草单位：山东省农业科学院畜牧兽医研究所。本标准主要起草人：陈蕾、杜以军、齐静、丛晓燕、孙文博、陈智、郭立辉、于江、吴家强、李俊、时建立。1DB37/T3086—2017猪附红细胞体PCR检测技术1范围本标准规定了猪附红细胞体PCR检测技术的操作要求本标准适用于猪附红细胞体的实验室诊断、监测和流行病学调查等。2实验室生物安全要求实验室必须为生物安全Ⅱ级(BSL-2级)及以上实验室。3规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和实验方法4术语与定义下列术语与定义适用于本标准。聚合酶链式反应。十二烷基硫酸钠。5仪器设备和试剂5.1仪器设备5.1.1微量移液器(最大量程分别为10μL、20μL、100μL、1000μL),带滤芯的枪头。5.1.220000r/min低温高速离心机。5.1.3电热恒温水槽。5.1.4稳流稳压电泳仪。5.1.5水平电泳槽。5.1.6凝胶成像系统。5.1.7紫外透射反射分析仪。5.1.8电磁炉。5.1.9烧杯(1000mL)。2DB37/T3086—20175.1.10电子天平精度为：0.001g。5.1.132℃~8℃冰箱。5.2试剂除另有规定外，所有生化试剂均为分析纯。5.2.1蛋白酶K(见附录A.1)。5.2.210%SDS液(见附录A.2)。5.2.370%乙醇(见附录A.3)。5.2.41.0%琼脂糖凝胶(见附录A.4)。5.2.6超纯水：符合GB/T6682,三级。MS-Fwd:5-CGAGCGCAACCCTTCATAT-3;MS-Rev:5-CTACCATTGTAGCACGTTTGCA-3;扩增片段大小127bp。6操作程序6.1样品的采集和处理临床上猪的血液(肝素抗凝血),置于2℃~8℃冰箱保存。6.1.2.1取肝素抗凝血液约5ml。6.2.1取肝素抗凝血500μL于1.5mL离心管中，加入50μg/mL的蛋白酶K5μL,加入10%的6.2.5取上清于一新离心管中，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃静置20min,10000g离心15min,6.2.6加入70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁，弃乙醇，晾干。6.2.7加入100μL灭菌双蒸水溶解沉淀，-20℃保存备用。试验中同时设立猪附红细胞体DNA作为阳性对照和灭菌双蒸水作为阴性对照。3DB37/T3086—2017序号体系组成体系含量1灭菌双蒸水2DNA310mmol/L上游引物410mmol/L下游引物510×PCRBuffer62.5mmol/LdNTPs7Taq酶首先加入双蒸灭菌水，然后按顺序逐一加入上述成分，每次要加入到液面下。全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到PCR管底。循环参数为95℃5min,94℃30s,52℃45s,72℃1min,6.4.1制备1.0%琼脂糖凝胶板，见附录A.4。6.4.3加入分子量标准。6.4.5用凝胶成像仪观察、扫描图片存档。6.4.6用分子量标准比较判断PCR片段大小。7.1在阳性对照出现127bp扩增带、阴性对照无此扩增带时，实验结果成立(参见附录A.5)。7.2被检样品出现127bp扩增带判定为猪附红细胞体阳性，未出现相应扩增带的样品判定为猪附红细胞体阴性(参见附录A.6)。4DB37/T3086—2017(规范性附录)试剂的配制A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)