《RNA建库流程》课件

RNA建库流程本课件旨在介绍RNA建库的完整流程，从样品制备到测序数据分析，并深入探讨关键步骤和注意事项。课程大纲RNA提取从生物样本中提取总RNA。RNA纯化去除样本中的DNA和蛋白等杂质。RNA质量检测评估RNA的完整性和纯度。rRNA去除去除样本中的rRNA，以富集mRNA。建库流程示意图展示RNA建库的各个步骤。文库构建将RNA片段转化为可测序的DNA文库。高通量测序使用高通量测序仪对文库进行测序。生物信息分析对测序数据进行分析，解读生物学意义。RNA提取细胞裂解使用裂解液破坏细胞膜，释放RNA。RNA分离通过离心或磁珠分离技术，去除蛋白质和其他细胞成分。RNA沉淀加入异丙醇或乙醇，使RNA沉淀下来。RNA洗涤用75%乙醇洗涤RNA沉淀，去除残留杂质。RNA溶解用RNase-free水溶解RNA，获得最终的RNA样本。RNA纯化1去除杂质去除样品中的蛋白质、脂类、多糖等杂质，确保RNA的纯度和完整性。2浓缩RNA将稀释的RNA溶液浓缩至适合后续实验的浓度，提高RNA的浓度和质量。3去除DNA通过DNase消化或其他方法去除残留的DNA，确保RNA样品中不含有DNA污染。RNA质量检测1RNA完整性评估RNA完整性，确保RNA未降解2RNA纯度检测RNA纯度，确保RNA不受污染3RNA浓度确定RNA浓度，用于后续实验RNA完整性评估1RNA完整性评估RNA完整性，判断是否适合后续实验。2电泳分析使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。3RIN值使用Bioanalyzer或Agilent2100检测RNA完整性并计算RIN值。RNA定量分析核酸浓度使用NanoDrop或Qubit等仪器测定RNA的浓度，确保样本量足够进行后续操作。RNA纯度通过OD260/280和OD260/230比值判断RNA纯度，避免蛋白质或其他污染物干扰后续实验。rRNA去除1目的降低rRNA比例，提高mRNA比例，提高测序效率。2方法RNaseH降解rRNA，磁珠捕获rRNA。3重要性rRNA占总RNA的80%，去除rRNA可以提高后续mRNA测序的准确性。mRNA富集1去除rRNA选择合适的试剂盒，如Oligotex、RNaseH、磁珠等进行富集。2纯化mRNA使用oligo(dT)磁珠或柱子结合mRNA，并洗脱纯化。3定量分析使用NanoDrop或Qubit仪器进行定量分析，确保mRNA浓度足够。建库流程示意图RNA提取从样本中提取高质量的总RNARNA质量检测评估RNA完整性和纯度文库构建将RNA片段化并添加接头高通量测序利用测序仪对文库进行测序文库构建1文库质量检测评估文库质量，确保测序效率2扩增与纯化扩增文库以获得足够的测序量3接头连接连接测序接头，方便后续测序4碎片化与末端修复将RNA片段化，并修复末端碎片化与末端修复1RNA片段化将RNA打断成特定长度的片段，便于后续建库步骤。2末端修复对RNA片段进行修饰，使其具有平滑的末端，有利于下一步接头连接。3添加A尾在RNA片段的3'端添加一个A碱基，为下一步接头连接做准备。接头连接1连接酶使用T4DNA连接酶2温度16℃反应15分钟3目的将接头连接到DNA片段两端扩增与纯化1扩增PCR扩增2纯化磁珠纯化文库质量检测片段大小分布使用生物分析仪或芯片检测文库片段大小分布，确保文库片段大小符合预期范围，并排除异常片段的影响。文库浓度使用Qubit或Nanodrop等仪器检测文库浓度，确保文库浓度达到测序要求，避免出现测序数据质量下降的情况。文库质量评估使用AgilentBioanalyzer或TapeStation等仪器进行文库质量评估，分析文库的完整性、纯度和片段大小分布，确保文库质量符合测序要求。测序准备1文库质量控制对文库进行必要的质量检测，确保文库质量符合测序要求。2测序平台选择根据研究目标和数据需求，选择合适的测序平台。3测序参数设置设置测序深度、读长等参数，满足实验需求。4样品准备将准备好的文库进行稀释和混合，按照测序平台要求进行样品准备。高通量测序1文库制备将待测DNA或RNA片段制备成可用于测序的文库。2上机测序将文库加载到测序仪上，进行高通量测序。3数据分析对测序获得的原始数据进行分析，获得生物学信息。生物信息分析1数据质控去除低质量reads2序列比对与注释将reads比对到参考基因组3差异表达分析识别不同样本间的基因表达差异4功能富集分析分析差异表达基因的功能数据质控测序数据过滤去除低质量reads，提高数据可靠性。碱基质量评估分析测序质量，确保数据准确性。序列长度分布统计reads长度，评估文库构建效果。序列比对与注释1比对将测序得到的RNA序列与参考基因组或转录组数据库进行比对2注释根据比对结果，确定RNA序列对应于基因组中的哪个基因或转录本3功能分析结合基因或转录本的功能信息，分析RNA序列的功能差异表达分析数据预处理对原始数据进行质量控制、归一化、过滤等处理，去除噪音和偏差。差异表达基因筛选利用统计学方法，筛选出不同样本组间表达差异显著的基因。结果可视化以火山图、热图等形式展示差异表达基因的分析结果。功能富集分析1基因集富集分析确定差异表达基因集中富集的生物学通路或功能。2GO富集分析分析差异表达基因集在基因本体（GO）数据库中富集的条目。3KEGG富集分析分析差异表达基因集在KEGG数据库中富集的代谢通路或信号通路。通路分析1KEGGKyotoEncyclopediaofGenesandGenomes2GOGeneOntology3ReactomeAcuratedknowledgebaseofbiologicalpathwaysandreactions验证实验设计1qRT-PCR验证独立样本验证差异表达基因2WesternBlot验证蛋白表达水平变化3功能实验验证基因功能影响qRT-PCR验证1实验设计选择合适的内参基因和目的基因。2RNA提取使用合适的试剂盒提取总RNA，并进行质量检测。3cDNA合成利用逆转录酶将RNA逆转录为cDNA。4qPCR反应使用qPCR试剂盒，设置合适的反应体系，进行qPCR反应。5数据分析使用合适的软件对qPCR数据进行分析，得出目的基因的表达量。结果讨论差异表达基因分析分析结果表明，与对照组相比，实验组中存在显著差异表达的基因。这些基因可能与特定生物过程或疾病状态相关联。功能富集分析对差异表达基因进行功能富集分析，可以揭示这些基因所参与的生物途径和相关功能，提供更深入的生物学见解。通路分析通路分析可以帮助我们理解差异表达基因如何相互作用，并影响特定的生物途径，从而揭示更完整的生物学机制。注意事项严格控制实验时间，避免RNA降解。注意试剂的质量和储存条件。做好实验记录，确保实验结果的可重复性。实验设备1RNA提取仪用于快速高效地从样品中提取RNA。2定量PCR仪用于检测RNA的浓度和完整性。3超声波破碎仪用于将RNA片段化成合适的长度。常用试剂RNA提取试剂Trizol,TRIzolLS,RNeasyMiniKit,RNAzolRT等RNA纯化试剂DNaseI,RNase-FreeDNase,GlycoBlue等文库构建试剂NEBNextUltraIIRNALibraryPrepKitforIllumina,TruSeqStrandedmRNALibraryPrepKit等测序试剂IlluminaSequencingKits,NovaSeq6000ReagentKits等参考文献RNASequencing:APowerfulToolforTranscriptomeProfilingAComprehensiveGuidetoRNALibraryPreparationf