义翘讲堂《解析流式细胞实验设计技巧分享应用型抗体开发策略》

免疫实验技术全攻略解析流式细胞实验设计技巧分享应用型抗体开发策略孙月红FCM资深实验专家北京义翘神州科技股份有限公司义翘神州CONTENT流式概述与实验要点1流式实验常见问题汇总2流式应用型抗体开发策略3流式概述与实验要点01义翘神州流式VS荧光显微镜流式荧光显微镜单个、流动、依次视野、静止、同时PMT肉眼/CCD细胞群体特征量分布细胞内部结构信息流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据WB：群体分析，得到多个细胞的平均值流式VSWB流式细胞术（FlowCytometry）：单细胞或生物颗粒、多参数、高通量、快速、定量、分选义翘神州细胞固有参数前向角散射光（FSC）：入射激光的同向散射光信号，反应细胞相对大小及其表面积。侧向角散射光（SSC）：入射激光90

角的散射光信号，反应细胞粒度及细胞内相对复杂度。粒细胞单核细胞淋巴细胞流式细胞仪的信号——散射光信号义翘神州源自：细胞自发荧光：细胞自身在激光照射下，发出微弱荧光信号，噪声信号。特异性荧光信号：细胞经荧光素标记后，受激光照射得到的荧光信号。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的荧光信号区分开，送入不同的光电检测器。选择不同的单抗及染料可同时测定单个细胞的多个不同参数。流式细胞仪的信号——荧光信号义翘神州源自：源自：检测指标选择抗体搭配荧光素样品制备样品质量实验对照实验细节上机检测仪器设置补偿调节收集细胞数目数据分析分析方式流式技术关键环节义翘神州方案设计常用免疫细胞标记物义翘神州白细胞CD45+髓系细胞淋巴细胞T细胞CD3+初始T细胞CD45RA+CCR7+中央记忆T细胞CD45RA-CCR7+效应记忆T细胞CD45RA-CCR7-终末效应记忆T细胞CD45RA+CCR7-TregCD4+CD25+CD127lowFoxP3+Tc细胞CD8+Th细胞CD4+Th1IFNγ-Th2IL4+Th17IL17+γδT细胞TCRγδ+NKT细胞CD3+CD56+NK细胞CD3-CD56+CD56brightCD16low/-CD56dimCD16+B细胞CD19+初始B细胞IgD+CD27-边缘区B细胞IgD+CD27+记忆B细胞IgD-CD27+单核细胞经典CD14++CD16-非经典CD14+CD16++中间型CD14+CD16+嗜碱性粒细胞CD3-CD14-CD19-CD56-HLA-DR-CD123+FcER1+先天淋巴细胞CD3-CD14-CD19-CD56-CD2+CD127+树突状细胞pDCCD3-CD19-CD56-CD14-HLA-DR+CD11C-

CD123+cDCCD3-CD19-CD56-CD14-HLA-DR+CD11C+CD123-+:positive/highexpression-:negative/lowexpressionKeycDC1CD141+FCER1-cDC2CD141-FCER1+常用免疫细胞标记物义翘神州T细胞CD3+初始T细胞CD44-CD62L+中央记忆T细胞效应记忆T细胞TregCD25+FoxP3+Tc细胞CD8+Th细胞CD4+Th1IFNγ-Th2IL4+Th17IL17+γδT细胞TCRγδ+NK细胞CD3+CD49B+/NK1.1+NKT细胞B细胞CD19+/B220+浆母细胞B220+CD138+浆细胞记忆B细胞单核细胞经典Ly6C+巨噬细胞DC细胞pDCCD3-CD49B-Ly6G-CD11C+CD11B-

B220+pDCA1+cDCCD3-B220-CD49B-Ly6G-Ly6C-CD11B+CD11C+MHCII+cDC1XCR1+CD172-cDC2XCR1-CD172+CD44+CD62L+CD44+CD62L+TfhCXCR5+PD1+CD3+CD49B+/NK1.1+B220-CD138+B220+CD138-GL7-CD38+生发中心B细胞B220+GL7+FAS+非经典Ly6C-CD11B+CD115+Ly6G-CD11B+F4/80+Ly6G-M1型CD80+CD26-M2型CD80+CD26+中性粒细胞CD3-B220-Ly6G+CD11B++:positive/highexpression-:negative/lowexpressionKey白细胞髓系细胞淋巴细胞CD45+目标蛋白特异性识别种属正确首选直标抗体可用于流式实验抗体选择义翘神州多靶点：1600余株FCM抗体多种属：人、大鼠、小鼠、猴等多荧光素标记：FITC、PE、PerCP、APC配套试剂盒：AnnexinV/7-AAD凋亡检测试剂盒人间充质干细胞检测试剂盒Ⅰ多细胞筛选HeLaLymophcytesAnti-HumanCD147-FITC(Cat:10186-R125-F)Lymophcytes蓝色直方图：CD19抗体预先与过量的CD19重组蛋白孵育橘色直方图：CD19抗体预先与过量的无关蛋白孵育Anti-HumanCD19(Cat:11880-MM17)Lymophcytes蓝色直方图：细胞与过量的CD21非标记抗体（货号：10811-MM02）后，再加入CD21FITCAnti-HumanCD21-FITC(Cat:10811-MM02-F)国外品牌CD14-FITC(M5E2)monocytesmonocytesAnti-HumanCD14-FITC(Cat:10073-MM06-F)Ⅱ蛋白竞争Ⅲ非标记抗体竞争Ⅳ经典克隆对比抗体选择义翘神州荧光亮度光谱重叠荧光素的特性荧光素搭配义翘神州荧光与仪器相匹配激光器、检测通道数量及具体参数荧光素亮度与抗原表达相匹配了解抗原表达强弱及荧光素亮度Ⅱ多色组合考虑荧光素的光谱重叠在同一细胞上表达的抗原光谱重叠最小化采用多激光激发减少光谱重叠其他注意事项有些荧光素可被多个激光器激发串联染料易降解……Ⅳ每个通道只能选择一种荧光素各个通道之间的荧光素可以随意搭配高表达的抗原可用不太亮的荧光素低表达的抗原尽量用亮的荧光素了解荧光素的激发光及发射光谱了解荧光素特性ⅠⅢ荧光素搭配义翘神州外周血骨髓组织块培养的细胞脱落的细胞原则确保高质量的单细胞悬液尽可能减少碎片和死细胞单细胞悬液制备义翘神州排除特定亚型荧光素抗体的非特异性染色背景。指用同种细胞，染上去掉一种荧光素的其它所有荧光素。体现出各种荧光素对未标记通道的渗漏。确定染色背景及细胞的自发荧光水平。自发荧光会干扰FITC、PacificBlue等荧光素检测，降低信号分辨能力，导致假阳性。FL-1(FITC)FL-2(-)FITC单标FL-1(-)FL-2(PE)PE单标对照设置义翘神州Ⅱ单染对照Ⅲ同型对照ⅣFMO对照Ⅰ阴性对照优化抗体使用浓度Ⅰ鼠脾细胞与不同浓度的CD27FITC(50110-R012-F)染色结果抗体滴定方法：使用实验时要用的同种细胞，固定细胞量与反应体积，加入不同量的抗体，计算阳性峰荧光强度及信噪比（S/N）

1、滴定的浓度范围尽量大，做5个左右梯度。

2、滴定实验条件要和实际的实验条件一致，如反应温度、反应体系。3、用于滴定抗体的标本中，确保有阴性细胞。

实验技巧义翘神州Ⅱ排除死细胞干扰死细胞的自发荧光水平很高死细胞容易摄取抗体导致非特异性结合，最终影响实验结果死细胞还可能会释放DNA。DNA非常粘稠，会导致细胞成团，容易堵塞管路LiveAll区分死细胞的方法死细胞特性：细胞膜渗透性增强，失去膜完整性1、DNA结合染料：PI、DAPI、7-AAD、TO-PRO-3等DNA染料只会进入细胞膜受损的细胞，结合到细胞的DNA上。2、蛋白结合染料：结合细胞表面或膜内的游离胺，活细胞弱阳，死细胞强阳，可以用在固定标本中。代表产品：live/dead可固定染料实验技巧义翘神州Ⅲ封闭Fc受体Fc受体是指细胞表面能够与免疫球蛋白（IgG、IgA、IgM、IgE和IgD）结合的分子，存在于NK细胞、肥大细胞、巨噬细胞、中性粒细胞的表面。FcR能够与抗体的Fc段结合，在检测时产生假阳性。FcR封闭前FcR封闭后Fc受体封闭试剂（1）商品化的FcBlock试剂：重组人IgG、小鼠CD16/CD32抗体（2）人血清或相应物种的血清实验技巧义翘神州我在实验中应该获取多少个细胞？我的结果中有多少个细胞才有意义？上机检测义翘神州1、目标细胞群比例高，获取10000个细胞2、目标细胞群比例低（1%以下）：数据真实性：排除死细胞、碎片造成的非特异性信号设置完整的实验对照多次重复实验阳性率（P）10%5%1%0.10%0.01%细胞总数（N）500010000500005000005000000阳性细胞数（R）500500500500500方差（Variance）450475495499.5499.95标准差（SD）21.2121.7922.2522.3522.36变异系数（CV）4.71%4.59%4.49%4.47%4.47%P=R/N，Variance=N*P*(1-P)，SD=ꇌVariance，CV=SD*100%/Variance单参数数据直方图每一个细胞单参数的测量数据可整理成分布统计，以分布直方图(distributionhistogram)来显示。横坐标表示荧光信号或散射光信号相对强度的值，纵坐标一般是相对细胞数。DNA倍体分析散点图密度图等高线图CD3CD4CD8CD45CD3双参数数据三维图数据分析义翘神州百分比绝对计数平均荧光强度（MFI）百分比的比较方式建立在父级细胞群数量不变的基础上1、绝对计数管：管中包含已知数量的微球2、有绝对计数功能的流式细胞仪：精确控制样本体积量，通过采集到的细胞数目、样本体积、总体积、绝对数目单位计算得到单位体积内特定细胞的总数1、Mean：算数平均数，用于线性正太分布2、GeometryMean：几何平均数，用于对数正态分布3、Median：中位数，不受数据形态分布的影响4、Mode：众数，数据最高峰所在的位置适合不分群而整体发生偏移的指标数据分析义翘神州对于异质性的样本，进行百分比分析更有意义义翘神州关注目标细胞群的绝对数合理使用MFI进行数据分析：不适用于异质性的样本谨慎比较不同次实验中的MFI数据分析流式实验常见问题汇总02义翘神州无阳性信号/信号弱确定待检抗原在待检细胞中的表达水平抗原与仪器是否匹配是否正确保存使用浓度是否适当间接染色是否使用了正确的二抗抗体胞内抗原检测，破膜是否充分表面分子染色前，有无做过固定样本制备过程抗原表达弱，建议搭配强荧光素抗体信号放大抗原更换合适的抗体荧光标记抗体一般保存方式为2-8℃，避光，避免冷冻调整抗体使用浓度抗体更换细胞破膜方式有些表面分子易受固定或酶消化影响，尽量避免表面染色前固定样本制备过程常见问题汇总义翘神州非特异性染色细胞活率是否过低细胞是否表达FcR样本使用浓度是否适当间接染色二抗是否与细胞交叉反应是否使用串联染料抗体使用活性染料排除干扰使用Fc受体封闭剂样本调整抗体使用浓度更换二抗更换荧光素抗体确保洗涤充分样本制备过程是否充分洗涤，尤其是胞内染色样本制备过程常见问题汇总义翘神州流式应用型抗体开发策略03义翘神州抗原设计表位差异性构象正确性抗原易获得性1免疫方案高滴度免疫效价多表位免疫反应识别功能位点2抗体筛选多样化筛选平台快速精准筛选鉴别多功能抗体3表达生产减少外源污染高产能（≥mg级）高通量4质控验证理化检测功能验证5抗体平台关键技术环节义翘神州

抗原设计重组蛋白类免疫原多肽不同膜蛋白形式细胞其他类型免疫原核酸义翘神州杂交瘤技术噬菌体展示文库技术单B细胞分选技术高效的抗体开发技术平台：经典技术优化：电融合，建库技术新技术：单个B细胞技术，更快的速度多种筛选方案组合高效的重组抗体表达高质量的候选抗体库：数百-数千个候选抗体亲和力达到nM-pM水平不同的抗原结合表位适用于不同应用场景Beacon®技术

四大单克隆抗体制备技术义翘神州根据最终需求选择合适的免疫原、佐剂、免疫方式动物免疫效价检测筛选方式ELISA效价检测为主，辅助Fc检测多样化抗体筛选平台，关键环节进行Fc功能介入筛选功能需求为导向，尽早开展应用特异性筛选流式应用抗体开发义翘神州免疫原：Daudi细胞流式检测商品化anti-CD45RA-PE商品化anti-CD45RA-PE（CD45RA-MM27封闭）

流式抗体筛选案例1CD45RA抗原表达lymphocytesKG-1U937HL60K562JurkatMOLT-4RPMI8226RajiDaudiMG63SKO-007二抗anti-CD45RA-MM27+二抗RajiHL60Lymphocytes义翘神州种属：小鼠筛选平台：杂交瘤二抗对照抗体24447-M017324447-M0165

流式抗体筛选