抗体制备技术

抗体制备技术医学检验学院李会强Email：lihuiqiang1965@163.comAntibody，AbB细胞识别抗原后，增殖、分化为浆细胞所产生的一种蛋白质，主要存在于血清等体液中，能与相应抗原特异性结合。IgG如何评价抗体质量？效价（稀释度）特异性（交叉反应率）亲和性（平衡常数）纯度（IgG）种类（人工制备抗体）多克隆抗体（免疫血清）

Polyclonalantibody，PcAb单克隆抗体

Monoclonalantibody，McAb基因工程抗体

GeneticengineeringantibodyPart1

00000000免疫原的制备Part2

多克隆抗体的制备Part3

单克隆抗体的制备Part1

00000000免疫原的制备Part2

多克隆抗体的制备Part3

单克隆抗体的制备免疫原

Immunogen指用于制备抗体的抗原（antigen）或半抗原（hapten）免疫原颗粒性血细胞或细菌

可溶性完全抗原半抗原-载体合成肽-载体如何纯化单一蛋白质抗原？制备组织匀浆细胞溶解或破碎选择性沉淀色谱分离鉴定溶解细胞的措施超声粉碎反复冻融溶菌酶裂解？常规纯化蛋白技术盐析色谱凝胶色谱离子交换色谱亲和色谱色谱免疫亲和色谱纯化抗原重要手段关于佐剂使用说明

佐剂Adjuvant指能够增强免疫应答或改变免疫应答类型的物质，应用时可与抗原同时或预先注射于机体。佐剂本身可以有免疫原性，也可以没有免疫原性。佐剂种类：具有免疫原性抗酸杆菌（BCG）无免疫原性福氏佐剂氢氧化铝常用：福氏佐剂FreundadjuvantComplete

Freundadjuvant

羊毛脂石蜡油

BCGInCompleteFreundadjuvant

羊毛脂石蜡油使用原则：颗粒性抗原一般情况下不需使用；可溶性大分子量的蛋白质免疫原、人工抗原，初次免疫时必须使用佐剂；不连续两次使用完全福氏佐剂，以免导致动物严重反应；Part1

00000000免疫原的制备Part2

多克隆抗体的制备Part3

单克隆抗体的制备多克隆抗体免疫血清如何获得高质量免疫血清？免疫原合适动物免疫方案制备理想免疫原选择免疫动物确定免疫方案实施免疫程序检测抗体效价采血分离血清抗体纯化鉴定如何选择动物？免疫原与动物种属关系动物个体状况的选择抗血清用量和要求免疫方案免疫剂量体积和浓度

免疫途径

次数与间隔全量免疫方案微量免疫方案采血方法

待抗体效价合格，需加强免疫，3~5日后采血，采血前需禁食

外周静脉颈动脉插管

心脏穿刺抗体纯化

特异性

确保与类似物质不发生结合

蛋白纯度

丙球IgGFab纯化-免疫血清

特异性

免疫原的纯度

后期纯化

免疫吸附

交叉抗原（反向吸附）

特性抗原（正向吸附）抗体纯化

纯度

饱和硫酸铵盐析

蛋白A亲和层析盐析后需除盐ProteinA蛋白A亲和层析pH7.4PB平衡pH3洗脱缓冲液pH8.9结合缓冲液pH6洗脱缓冲液pH3洗脱缓冲液鉴定

特异性

效价

亲合力

纯度PcAbMcAb免疫血清储存冷冻保存冷冻干燥保存4℃保存Part1

00000000免疫原的制备Part2

多克隆抗体的制备Part3

单克隆抗体的制备定义单克隆抗体monoclonalantibody，McAb由单个杂交瘤细胞增殖而成的细胞克隆产生的，针对某一抗原表位的、完全均一的、单一特异性的抗体克隆选择学说B细胞表面具有单一一种抗原受体，只识别一种抗原表位，并产生针对该表位的抗体。clonalselectiontheoryhybridomacell杂交瘤技术关键亲本细胞与选择细胞的融合

选择培养基与杂交瘤细胞的实现亲本细胞

免疫脾细胞

抗原致敏且分泌抗体

骨髓瘤细胞

长期在体外无限繁殖免疫脾细胞

动物免疫

同免疫血清制备

制备脾细胞悬液BALB/c小鼠骨髓瘤细胞（SP2/0

orNS1）选择有HGPRT或TK缺陷的细胞株；次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）胸苷激酶（TK）与B细胞杂交形成稳定的杂交瘤细胞；骨髓瘤细胞本身不分泌免疫球蛋白；具有较高融合效率；骨髓瘤细胞（SP2/0

orNS1）

确保

酶缺陷（需验证）状态（活力）+8-

AzaguanineMyelomaCellsHGPRT-MyelomaCells融合（fuse）

生物法

化学法PEG

物理法筛选杂交瘤细胞筛选杂交瘤细胞选择培养基HAT次黄嘌呤（H）氨基蝶吟（A）胸腺嘧啶（T）要点：免疫脾细胞的制备骨髓瘤细胞的培养与筛选

细胞融合筛选阳性克隆克隆化抗体的大量制备融合：关键一步；融合前亲本细胞需经预处理；融合于37℃水浴中进行；注意两种亲本细胞的比例；选择高质量细胞融合剂；缓慢终止融合作用；DerivedfromdifferentBLymphocytescelllinesPOLYCLONAL.MONOCLONAL.DerivedfromasingleBcellcloneBatchtoBatchvariationaffectingAbreactivity&titremAbofferReproducible,Predictable&Potentiallyinexhaustiblesuppl