植物的细胞培养

植物的细胞培养第一节、单细胞的分离与培养一、分离单细胞的方法

1、物理方法

2、化学方法

3、酶法第2页,共55页，星期六，2024年，5月1、物理方法将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好。2、化学方法是在细胞悬浮培养中加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（对细胞分散有一定的作用）。3、酶法利用果胶酶和纤维素酶使细胞分离。第3页,共55页，星期六，2024年，5月二、单细胞的培养方法

平板培养

看护培养

液体浅层培养

微室培养（微滴培养）第4页,共55页，星期六，2024年，5月1、平板培养

定义：将一定量细胞接种到或混合到装有一薄层固体培养基的培养皿内进行培养的方法。第5页,共55页，星期六，2024年，5月

技术要点：

单细胞悬浮液的制备：先过滤细胞悬浮液，去掉全部组织块和大的细胞团，获得含单细胞或4-6个的细胞团的悬浮液

调节细胞密度；

固体培养基的制备；

接种细胞：把单细胞悬浮液转移到琼脂平板上，铺成大约1mm的薄层，然后观察细胞植板率。第6页,共55页，星期六，2024年，5月

植板率：它以能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例来表示。

优点：便于定点观察；

缺点：通气性较差。植板率(％)＝形成的细胞团数接种的细胞数×100％第7页,共55页，星期六，2024年，5月2、看护培养1953年Muir创立；定义：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法；具体方法：将单个细胞接种于滤纸上，再置于愈伤组织上培养。第8页,共55页，星期六，2024年，5月此法适用于难于培养的植物种类

优点：简便、成功率高缺点：不能在显微镜下直接观察第9页,共55页，星期六，2024年，5月3、液体浅层培养

技术：先将细胞制成一定密度的细胞悬浮液，用吸管将悬浮液移到培养皿中形成浅层，一般1mm左右，石蜡膜封口，静置培养。

优点：、培养物与空气接触面大，通气性好；

、细胞代谢产物容易扩散，不会造成有害物质的危害；、继代培养方便、便于观察。

缺点：由于细胞可以游动，不能进行定点观察第10页,共55页，星期六，2024年，5月4、

优点：可以连续观察细胞的分化和发育；

缺点：通气性差，水分难保持，pH易变动。

第11页,共55页，星期六，2024年，5月5、悬浮细胞培养：将细胞接种于液体培养基中培养。（单独讲解）第12页,共55页，星期六，2024年，5月第二节、悬浮细胞培养

悬浮培养(suspensionculture):

是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。第13页,共55页，星期六，2024年，5月一、悬浮培养的过程：第14页,共55页，星期六，2024年，5月二、悬浮培养的优点：

一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；

二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；

三是振荡培养可以适当改善气体的交换；第15页,共55页，星期六，2024年，5月三、悬浮培养过程中细胞生长情况分析测定方法：1、细胞计数：单位体积细胞浓度；2、细胞体积：培养物离心后测定细胞层所占的体积；3、细胞鲜重或干重：过滤或干燥后称重第16页,共55页，星期六，2024年，5月四、悬浮细胞培养的同步化方法（一）物理方法（二）化学方法第17页,共55页，星期六，2024年，5月1、体积选择法：将培养细胞经过一定大小的筛网过滤，对细胞按大小分别进行收集。2、冷处理法：先收集细胞，后在低温（一般为4度）下处理一定时间后加培养液培养。（一）物理方法第18页,共55页，星期六，2024年，5月1、饥饿法：控制营养使细胞处于饥饿状态，后加营养培养；2、有丝分裂抑制法：向培养液中加入化学抑制剂抑制细胞分裂，包括尿苷、秋水仙素（二）化学方法第19页,共55页，星期六，2024年，5月五、一个成功的悬浮细胞培养体系必须满足三个条件：

悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；

均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；

细胞生长迅速（2～3天加倍）。第20页,共55页，星期六，2024年，5月六、悬浮细胞培养方法

分批培养法

半连续培养法

连续培养法第21页,共55页，星期六，2024年，5月

分批培养法：

●是一种封闭的培养体系，培养过程中不放出培养液，也不补加培养液；

●培养方法：旋转培养；往返培养；旋转振动；搅动培养；第22页,共55页，星期六，2024年，5月

在培养过程中，每隔一定时间更换一部分培养液或添加某种营养成分。

半连续培养法

连续培养法

通过控制连续添加和排出的新老营养液的量，维持培养液体积恒定，据操作的不同又可分为封闭式和开放式两种。●封闭式：回收流出的细胞于培养系统中，细胞数目增加●开放式：流出的细胞不回收于培养系统中，但进行细胞收获第23页,共55页，星期六，2024年，5月七、影响悬浮细胞生长的因素：

起始愈伤组织的质量；

接种细胞密度；

培养条件：方式、温度；

继代周期。第24页,共55页，星期六，2024年，5月八、细胞的保存

继代培养保存法：细胞定期继代培养，常用；

低温保存法：5－10度温度下培养并定期更换培养液；

冰冻保存法：分为低温保存（－20度）和超低温保存（液氮保存）第25页,共55页，星期六，2024年，5月第三节、植物细胞培养的应用

植物细胞含有人类所需的成分，包括初生代谢物（蛋白质、碳水化合物、脂肪等）和次生代谢物（多酚类、香精油、生物碱、树脂等），传统提取分离这些物质由于资源短缺和需求量的加大，难以满足需求，通过细胞培养生产植物产品成为解决的有效途径。

第26页,共55页，星期六，2024年，5月（一）、细胞培养的主产品1、药用代谢产物

生物碱（吡啶、喹啉）、蛋白质类（氨基酸、植物抗生素、）、酚类化合物（黄酮类、单酚类、醌类）、萜类化合物（三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜）等。豆杉细胞紫杉醇（抗癌药物）紫草细胞紫草宁（烧伤、痔疮）例子：第27页,共55页，星期六，2024年，5月2、天然食品、食品添加剂色素（胡萝卜素、叶黄素、单宁）、甜味剂（甜菊苷）、香料物质、饮料（可可碱、咖啡碱）等；3、杀虫剂、杀菌剂万寿菊细胞中获得农药噻吩烷；鹰嘴豆细胞中得到除虫菊脂；香草细胞中分离到鱼藤酮杀虫剂等；4、饲料、精细化工产品桑细胞培养养蚕饲料银胶菌细胞培养橡胶第28页,共55页，星期六，2024年，5月（二）、细胞培养技术的优点1、培养细胞是在无菌条件下生长的,不受地区、季节和气候限制；2、占地面积少；3、天然产物的生产在控制的条件下进行,可以得到超越整体植物产量的代谢产物；4、能够产生原植物所没有的，甚至是至今在自然界还没有的化合物。第29页,共55页，星期六，2024年，5月（三）、植物细胞生物反应器

生物反应器的特点：

在可控制条件下（物理和化学），细胞得到大规模培养（工作体积大），而且单位体积生产能力高。第30页,共55页，星期六，2024年，5月1、植物细胞培养特性

细胞本身的特性

细胞培养液的流变特性

培养过程的气体传递与影响

泡沫与器壁表面黏附性

细胞分裂与愈伤组织的形成

悬浮细胞分批培养生长特点第31页,共55页，星期六，2024年，5月（1）、细胞本身的特性

细胞体积比微生物细胞大（10－200µm）,是微生物细胞的30－100倍；

植物细胞生长速度慢；

植物细胞壁易受机械剪切力的影响；

细胞常以非均相集合细胞团的方式生长第32页,共55页，星期六，2024年，5月（2）、细胞培养液的流变特性体现在两方面：

首先，细胞培养中易结团

其次，细胞培养过程中易产生黏多糖等物质，降低传氧速度，影响细胞生长。（3）、培养过程的气体传递与影响植物细胞培养需通过光合作用，植物细胞都好氧，因此培养过程需注意o2和co2的供应及比例关系。第33页,共55页，星期六，2024年，5月（4）、泡沫与器壁表面黏附性：

植物细胞在培养过程中易分泌黏多糖、蛋白质等物质导致黏度增大；

植物培养过程中易产生大量气泡。

对策：

利用消泡剂和在器皿表面涂抹硅油第34页,共55页，星期六，2024年，5月（5）、细胞分裂与愈伤组织的形成单个细胞3－5天内可观察到细胞分裂，根据培养的目的不同选取策略：

快繁种苗：细胞分裂长成小细胞团后形成小愈伤组织块，然后转到分化培养基上培养；

生产细胞代谢产物：分散细胞团，保持细胞分裂第35页,共55页，星期六，2024年，5月（6）、悬浮细胞分批培养生长特点

延迟期：也叫适应期，细胞很少分裂

对数生长期：细胞开始分裂，并以几何级数增加

减缓期：细胞分裂减速

静止期（稳定期）：生成的和死亡的细胞数目达到平衡，总数不变

衰亡期：细胞加快死亡第36页,共55页，星期六，2024年，5月2、生物反应器培养过程：1）、细胞的驯化、筛选与细胞株的建立

愈伤组织的诱导与培养

单细胞的分离（机械或酶解法）

细胞无性系的分离（过滤涂板培养）

细胞株的筛选（选疏松长势好的细胞

株，并测定细胞代谢物含量）第37页,共55页，星期六，2024年，5月

生长速度快；

目的代谢产物含量高；

适合悬浮细胞培养。适合大规模培养的细胞株应具备何条件？第38页,共55页，星期六，2024年，5月2）、扩大培养

逐级放大，用作培养的种子；

细胞株鉴定：经常鉴定，防止细胞株退化和变异。3）、生物反应器培养

培养方式同微生物，可以是分批培养、半连续培养、连续培养。第39页,共55页，星期六，2024年，5月2、影响生物反应器细胞培养的主要因素1）、细胞遗传特性

取材部位、细胞株的选择2）、培养的环境条件

主要因素包括光照、温度、搅拌与混合、通气、营养盐、pH、调节因子第40页,共55页，星期六，2024年，5月3、生物反应器培养系统

悬浮培养系统

固定化培养系统第41页,共55页，星期六，2024年，5月1）、悬浮培养系统

类型溶氧破坏性混合度限制因素气升搅拌式高低均匀细胞浓度高时有死角机械搅拌式中强较均匀细胞浓度高时混合不匀鼓泡式中低不均匀有死角，发生细胞沉降第42页,共55页，星期六，2024年，5月悬浮培养系统机械搅拌式气升搅拌式第43页,共55页，星期六，2024年，5月2）、固定化培养系统

特点：细胞固定而培养液循环流动

按照其支持物不同可以分为两大类：

A、包埋式固定化培养系统：琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺；

B、附着式固定化培养系统：尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维。第44页,共55页，星期六，2024年，5月

常见的几种固定化培养系统

流化床生物反应器：细胞包裹在胶粒、泡沫颗粒中，通入空气使固定化细胞悬浮于反应器中；

填充床生物反应器：细胞固定在胶粒、泡沫颗粒或连续的多个网中，细胞固定不动通过流动的培养液传质；

膜生物反应器：常见的是中空纤维和螺线式卷绕反应器，传质效率低，易阻塞，产物收获较困难，投资大。第45页,共55页，星期六，2024年，5月

流化床生物反应器

填充床生物反应器

膜生物反应器－－－中空纤维思考：固定化有何优势？第46页,共55页，星期六，2024年，5月(1)固相细胞接触紧密,生长缓慢,细胞拟组织化,有利于次生产物的积累；(2)细胞包埋在聚合物中得到保护，可以减少剪切力的损伤作用；(3)易于把细胞与培养液分开，更有利连续培养及生物转化过程的实现；

固定化细胞培养的优点：第47页,共55页，星期六，2024年，5月(4)高密度的细胞群体，可建立细胞间的物理、化学联系，细胞位置的相对固定，有利于物化梯度的建立，更有利于产物的合成;(5)环境条件易于控制，次生代谢物易于释放。存在的问题：a产物释放

b氧、养分传递第48页,共55页，星期六，2024年，5月

染色法：如用二乙酸荧光素（FDA）：活细胞能吸收并降解产生荧光，死亡细胞则无此现象。

呼吸强度测定法：采用氧电极法测定；

细胞生长速率的测定：对细胞数量或重量进行测定。

固定化细胞活力的测定：第49页,共55页，星期六，2024年，5月1、两步培养技术二、提高天然产物代谢新技术1977年Zenk提出：(1)维持培养基(maintenancemedia)

——尽可能快的使细胞量增长(2)生产培养基(prod