分析方法验证理论培训

目录一、前言二、分析方法验证

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基本概念

·方法验证的一般原则

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验证内容三、不同验证项目内容的具体要求

·准确度·线性·精密度·范围

·专属性·检测限·定量限·耐用性·系统适用性·溶液稳定性前言

在进行质量研究的过程中，一项重要的工作就是要对质量标准中所涉及到的分析方法进行方法学验证，以保证所用的分析方法确实能够用于在研药品的质量控制。方法验证 ——新方法的建立定义:

依据标准检验项目的要求,设定验证的内容,

设计合理的试验方案并完成操作的过程目的: 证明方法能够满足检验项目的要求作用:

方法建立的依据;制定质量标准的基础方法确认 ——已验证(如药典)方法的应用/方法转移目的:

证明在本实验室条件下的适用性,部分验证:

鉴别(专属性);含量测定(+重现性);杂质检查(+灵/重)·基本概念·方法验证的一般原则需验证的检验项目与方法鉴别;杂质检查(限度或定量);含量测定(定量)三个项目验证内容根据检验项目要求与分析方法特点确定无需验证的检验项目与方法外观,密度,酸值,pH,……氯化物,硫酸盐,干燥失重,炽灼残渣,……重量差异,崩解时限,装量,装量差异,……需特殊或非常规验证的方法粒度分布;旋光度;熔点;硬度·不同验证项目内容的具体要求1准确度测定结果与真实值/参考值接近的程度用回收率(%)表示在规定范围内验证验证方法见表3数据要求见表3表3准确度验证方法检验项目主成分含量测定有关物质测定方法验证时一般要求分别配制浓度为80％、100％和120％的供试品溶液各三份，分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率。验证时一般要求根据有关物质的定量限与质量标准中该杂质的限度分别配制三个浓度的供试品溶液各三份（例如某杂质的限度为0.2%，则可分别配制该杂质浓度为0.1％、0.2％和0.3％的杂质溶液），分别测定其含量，将实测值与理论值比较，计算回收率，并计算9个回收率数据的相对标准差（RSD）。接受标准各浓度下的平均回收率均应在98.0%-102.0%之间，9个回收率数据的相对标准差（RSD）应不大于2.0%。各浓度下的平均回收率均应在80%-120%之间，如杂质的浓度为定量限，则该浓度下的平均回收率可放宽至70%-130%，相对标准差应不大于10%。2线性检测结果与试样中被测物的浓度呈正比关系的程度在一定范围内验证验证方法见表4数据要求应列出回归方程、相关系数和线性图表4线性验证方法检验项目主成分含量测定有关物质测定方法在80％至120％的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定其主峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。在定量限至一定的浓度范围内配制6份浓度不同的供试液，分别测定该杂质峰的面积，计算相应的含量。以含量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归分析。接受标准回归线的相关系数（R）不得小于0.998，Y轴截距应在100％响应值的2％以内，响应因子的相对标准差应不大于2.0%。回归线的相关系数（R）不得小于0.990，Y轴截距应在100％响应值的25％以内，响应因子的相对标准差应不大于10%。3精密度多次测定同一均匀样品的结果之间的接近程度用SD或RSD%表示在规定范围内验证(限度±20%)验证方法同一实验室:

重复性(连续);中间精密度(不连续);不同实验室:

重现性(方法转移);方法见下表5数据要求多次测量值的SD或RSD%或平均值的可信限表5精密度验证方法检验项目主成分含量测定有关物质测定方法与标准

1）重复性

配制6份相同浓度的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试所得6份供试液含量的相对标准差应不大于2.0%。

2）中间精密度

配制6份相同浓度的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于2.0%。1）重复性配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，由一个分析人员在尽可能相同的条件下进行测试，所得6份供试液含量的相对标准差应不大于15%。

2）中间精密度配制6份杂质浓度（一般为0.1%）相同的供试品溶液，分别由两个分析人员使用不同的仪器与试剂进行测试，所得12个含量数据的相对标准差应不大于20%。4范围指在特定的范围内，方法可以提供可信的准确度、线性和精密度根据测试目的的不同，范围应至少涵盖如下浓度：含量：80~120%含量均匀度：70~130%溶出度/释放度：标准规定的±30%杂质：从规定的50%或定量限（两者取低者）到120%5专属性专属性系指：在其他成分（如杂质、降解物、辅料等）可能存在下，采用的分析方法能够正确鉴定、检出被分析物质的特性。应用:鉴别,检查,含量测定均验证专属性如采用的方法不够专属，应采用多个方法予以补充。不同验证项目接受标准见下表6表6专属性验证方法检验项目主成分含量测定有关物质测定方法1）在杂质可获得的情况下，可向试样中加入杂质或辅料，与未加杂质和辅料的试样比较测定结果，看结果是否收到干扰2）在杂质不能获得时，可通过测试含有杂质的试样与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样进行强光、高温、酸碱处理进行加速破坏，用两种方法进行测定比较测定结果。必要时可进行二极管阵列和质谱检测进行峰纯度检查。1）在杂质可获得的情况下，可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质与共存物质能得到分离和检出，并具有适当的准确度与精密度2）在杂质不能获得时，可通过测试含有杂质的试样与另一个已验证的方法或药典方法比较结果。或对试样进行强光、高温、酸碱处理进行加速破坏，研究可能的降解产物，并比对破坏前后检出的杂质个数。必要时可进行二极管阵列和质谱检测进行峰纯度检查。接受标准空白对照应无干扰，主成分与各有关物质应能完全分离，分离度不得小于2.0。以二极管阵列检测器进行纯度分析时，主峰的纯度因子应大于980。空白对照应无干扰，该杂质峰与其它峰应能完全分离，分离度不得小于2.0。6检测限(LOD)定义:

样品中被分析物可检出的最低量应用:杂质检查项,根据具体情况确定是否验证限度试验——验证定量测定——根据定量限(LOQ)与报告限确定验证方法:信噪比法

即把已知低浓度试样检测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计

算出能被可靠的检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时的

相应浓度或注入仪器的量确定检测限。

检验项目主成分含量测定有关物质测定标准主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于3。7定量限(LOQ)定义:

样品中被分析物可定量测定的最低量

——测定结果的准确度与精密度符合要求应用:杂质定量测定(有关物质检查方法学研究)验证方法:信噪比法标准偏差法

检验项目主成分含量测定有关物质测定标准主峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液主峰的保留时间的相对标准差应不大于2.0%。杂质峰与噪音峰信号的强度比应不得小于10。另外，配制6份最低定量限浓度的溶液，所测6份溶液杂质峰保留时间的相对标准差应不大于2.0%，峰面积的相对标准差应不大于5.0%。8耐用性定义:

测定结果不受影响,条件允许变动范围

——测定结果的准确度与精密度符合要求应用:所有项目(与专属性一样)方法：见表7结果体现:范围窄——如HPLC柱温25±2℃,标注为25℃范围宽——如HPLC柱温10~30℃,无需标注方法耐用性影响因素示例表7耐用性验证方法检验项目主成分含量测定有关物质测定方法分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、流速相对值变化±20％时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。分别考察流动相比例变化±5％、流动相pH值变化±0.2、柱温变化±5℃、检测波长变化±5nm、流速相对值变化±20％以及采用三根不同批号的色谱柱进行测定时，仪器色谱行为的变化，每个条件下各测试两次。接受标准主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离；各条件下的含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%。

各杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，杂质峰与其他成分峰必须达到基线分离；各条件下的杂质含量数据（n=6）的相对标准差应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内。9系统适用性定义:是用来检验所采用的测试条件能否达到标准要求的条件，证明系统对于分析方法是适用的。——保证测试结果的可靠性 主要参数:分离度、柱效、重复性、拖尾因子检验项目主成分含量测定有关物质测定方法与标准配制6份相同浓度的供试品溶液进行分析，主峰峰面积的相对标准差应不大于2.0%，主峰保留时间的相对标准差应不大于1.0%。另外，主峰的拖尾因子不得大于2.0，主峰与杂质峰必须达到基线分离，主峰的理论塔板数应符合质量标准的规定。配制1份相同浓度的杂质溶液进行分析，各相邻组分分离度不得小于1.5。另外，杂质峰的拖尾因子不得大于2.0，理论塔板数应符合质量标准的规定。10溶液稳定性对照溶液:

室温,冰箱冷藏/进样室温度(2~8℃)供试溶液:室温/进样室温度(2~8℃)方法:与新制对照溶液比较——对照溶液稳定性与初始测定结果比较——供试品溶液稳定性检验项目方法接受标准有关物质测定按照分析方法分别配置对照品溶液与供试品溶液，平行测定两次主成分与杂质的含量，然后将上述溶液分别贮存在室温与冰箱冷藏室（4℃）中，在1、2、3、5和7天时分别平行测定两次主成分与杂质的含量。主成分的含量变化的绝对值应不大于2.0%，杂质含量的绝对值在±0.1％以内，并不得出现新的大于报告限度的杂质。分析方法再验证：在某些情况下，如原料药合成工艺改变、制剂处方改变、分析方法发生部分改变等，均有必要对分析方法再次进行全面或部分验证，以保证分析方法可靠，这一过程称为方法再验证再验证原则：根据改变的程度进行相应的再验证。举例：