细胞培养技术课件

在现代医学和生物科学研究中应用广泛

优点：1.直接观察活细胞的形态结构和生命活动。用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究.2.直接观察细胞的变化可便于摄影。3.研究细胞种类如低等到高等到人类、胚胎到成体、正常组织到肿瘤。在现代医学和生物科学研究中应用广泛

细胞培养技术4.便于使用各种技术：相差、荧光、电镜、组化、同位素标记等方法观察和研究细胞状况。5.是分子生物学和基因工程学的研究对象，也是其主要的组成部分。6.易于施用物理、化学生物的实验研究。7.易于提供大量生物性状相似的实验对象,耗资少比较经济。8.成为生物制品单克隆抗体生产和基因工程等的材料来源。细胞培养技术缺点：组织和细胞离体后独立生存在人工的培养环境中，虽然模拟体内环境，仍有很大差异。因而利用培养细胞做实验时，不应视为体内细胞完全相同，把实验结果推测体内，轻易做出与体内等同的结论。细胞培养技术七.细胞生存环境、条件和代谢

培养细胞生存途径和物质代谢与体内细胞基本相同，随生存环境改变出现一定差异。（一）环境培养环境无毒和无菌是保证培养细胞生存的首要条件。保证细胞生存环境无任何污染、代谢物及时清除，是维持细胞生存的基本条件。

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(二)温度：人哺乳动物：36.5℃±0.5℃;鸟类：38.5℃;

一般培养细胞对低温的耐受力比高温强温度上升不超过39℃时,细胞代谢强度与温度成正比。39～40℃1小时,受损伤的细胞可能恢复；41～42℃1小时,严重损伤,个别细胞恢复；43℃以上1小时，细胞全部死亡。细胞培养技术温度不低于0℃时,细胞代谢有影响,无伤害作用;置于25～35℃，细胞能生存，但生长速度减慢；放在4℃数小时,再放回37℃细胞仍继续生长。细胞代谢随温度降低而缓慢，温度降至冰点以下时,细胞因胞质结冰受损而死亡。细胞培养技术

(三)气体环境和氢离子浓度气体：氧气和二氧化碳

氧气:参与三羧酸循环产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。氧气分压1995～89975Pa,适用于封闭式单层细胞培养;开放式培养(碟皿或培养瓶松盖培养)细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。

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CO2:

细胞代谢产物,也是细胞所需成分。其主要作用维持培养基的pH值。大多数细胞的适宜pH7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。有些细胞存在差异。如羊水细胞培养检测染色体时pH为7.6。细胞培养技术

细胞耐酸比耐碱性大一些,在偏酸性环境中更有利于细胞生长。为了维持培养液恒定的pH，最常用磷酸缓冲剂方法。磷酸缓冲剂中NaHco3,可供给CO2但容易逸出，适用：封闭式培养的细胞。（无CO2培养箱）细胞培养技术

Hanks平衡液:

含有低浓度的NaHCO3,当打开含有Hank液培养瓶时，CO2迅速逸出而导致酚红指示剂变红，表明培养液pH变碱，细胞在碱性的环境中时间过长可使细胞碱中毒。

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羟乙基哌嗪乙硫磺酸(N`-2-HydroxyethylPiperazine-N`-EthanesulfonicAcid缩写HEPES)HEPES：

对细胞无毒性也不起缓冲作用，主要作用是：防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持恒定的pH。细胞生存所需基本物质细胞培养技术（四）细胞生存所需基本物质

与体内基本相同，除碳水化合物、氨基酸、脂类三大类营养物质外，一定量的无机盐、维生素和微量元素等，但需要的量以及代谢方式与体内细胞不尽相同。细胞培养技术糖：六碳糖是主要的能源通过糖酵解形成乳酸和通过柠檬酸形成CO2。胚胎细胞和一些转化细胞的培养基中常见到乳酸堆积现象。细胞培养技术糖是合成某些氨基酸的原料；经过乙酰辅酶A（CoA）合成脂肪；经过糖解磷酸通路能合成核酸。各种糖的吸收取决于它们进入细胞的能力,其中葡萄糖最强,半乳糖最低。细胞培养技术2.

氨基酸：

12种氨基酸：精氨酸(Arg)、胱氨酸(Cyst)、异亮氨酸(Zle)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、蛋氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、组氨酸(His)、酪氨酸(Tyr)、缬氨酸(Val)是细胞蛋白质合成的原料。

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所有细胞都需要谷胺酰胺，其特殊的作用,可促进各种氨基酸进入细胞膜。所含的氨是核酸中嘌呤和嘧啶的来源；是合成3，2和一磷酸腺苷时所需物;是能源和碳的来源。如没有谷胺酰胺细胞生长不良而发生细胞死亡。所以要求各种培养液中都含有较大量的谷胺酰胺。细胞培养技术

谷胺酰胺在溶液中不稳定，应放置在－20℃冰箱保存，用前加入培养液内。已含有谷胺酰胺的培养液在4℃冰箱内可放置两周以上时重新加入原来量的谷胺酰胺。细胞培养技术

需要维生素、生物素、叶酸、胭酰胺、核黄素、硫胺素、泛酸、吡多醇及B12等。这些维生素在常用培养基中已成为固定组成分。脂溶性维生素对细胞生长也有作用,一般从血清中得到补充。细胞培养技术

3.促生长因子：培养液除营养成分外，也需要激素类物质起到促进细胞增殖生长作用。胰岛素(1~10单位)促进细胞利用葡萄糖和氨基酸；氢化可的松(10-8~10-7M)促进表皮上皮细胞和乳腺上皮细胞增殖生长的作用，提高神经胶质细胞和成纤维细胞的克隆形成率；细胞培养技术

雌激素和雄激素，或使用黄体酮和氢化可的松对乳腺上皮细胞培养效果则更好。血清是提供生长因子和其细胞所需物质的来源。目前血清、各种组织和其它生物成分用生物工程的方法提取并商品化。

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4.

其它物质：

在细胞生长过程中,需要钾、钠、钙、镁氮和磷以外，还需要微量元素，如铁、锌、硒铜、锰、钼钒等。需要促细胞粘附物质其作用是：有助于促细胞贴附在各种底物或支持物上组织生长。细胞培养技术

5.人工培养基：

细胞在体外的生存环境是人工模拟的，除注意到无菌、温度、空气等条件外，最主要的是培养基，是供给细胞营养和保证细胞生长组织的物质。培养基的种类分为半固体和液体培养基两类。

液体培养基：分为合成、天然和无血清培养基三种。

细胞培养技术A．合成培养基：成分清楚,通过调节各种成分的数量和种类,再借观察细胞生物状况反应性变化,测定细胞与外界环境的适应能力。借以了解细胞生存条件,诱导细胞进行定向分化的等。

合成培养基在应用上广泛。细胞培养技术B．天然培养基：

用人或动物血清、血浆和胎汁等。常用牛血清。血清含有多种促生长因子、贴附因子及其它活性物质等。加入5％血清：维持细胞不死或缓慢生长；加入10％～20％血清：细胞增殖生长。细胞培养技术血清的主要作用提供细胞生存、生长和增殖所必需的生长调节因子。补充培养液中没有或量不足的营养成分。含有生长基质成分使细胞易贴附在培养器皿上。提供载体蛋白，可结合维生素、脂质、金属离子等。有中和毒性物质保护细胞不受伤害。提供蛋白酶抑制剂，保护细胞不受死细胞释放的蛋白酶的损害。细胞培养技术血清存在的问题存在有害于细胞生长和繁殖的物质。如补体、免疫球蛋白和一些生长抑制因子。成分不明确，影响对结果的分析。不同动物、不同批次的血清和活性差别较大，使培养的结果不稳定。细胞培养技术C.无血清培养基：培养基内加入促细胞生长因子，当前发现各种促细胞生长因子已达几十种。还有三碘甲状腺素、转铁蛋白及大鼠颌下腺粗提物。具有促进细胞生长增殖的作用。细胞培养技术

6.附着底物:

除少数悬浮型细胞外,绝大多数体外培养细胞需附着在适宜的底物上生长。不同细胞对底物要求不同，底物不适对细胞生长不良。细胞培养技术常用的底物：

A.玻璃：如用NaOH处理，性质能受到一定影响;酸中和以后再用（新的盐酸泡）易碎。B.一次性塑料：聚苯乙烯:多为一次使用。聚四氟乙烯包括：

细胞培养技术充电荷：亲水性，适用单层培养不充电荷：疏水性，适用巨噬细胞、转化细胞的培养。聚四氟乙烯透气性好可制成薄膜，剪成小块后放入各种瓶皿中，适于细胞贴附生长，也便于取出，可进行染色和做电镜切片。细胞培养技术C.微载体：由聚苯乙烯和聚丙烯酰氨混和制成小球体，附着面大，利于大量繁殖细胞。细胞培养技术D:饲细胞(Feedercells)：也称为滋养细胞，用成纤维细胞或其它细胞长成单层后，用大剂量射线照射，使细胞失去增殖能力，但能存活和有代谢活动。将其作为底物，其它细胞接种上面；饲细胞的代谢产物也有利于其它细胞生长。饲细胞用于：特殊难培养细胞，注意避免用同源细胞。细胞培养技术7.抑制细胞生长因素1.培养液消毒

2.操作不慎使有毒物质混在细胞生存的环境中，抑制细胞生长。3.血清灭活处理可除去补体和降低免疫球蛋白的毒性,并不损伤多肽生长因子，但可能消灭另一些更有用的营养成分，因此有人提出，灭活血清不一定比不灭活血清更好。细胞培养技术第二节

细胞培养

正常细胞

肿瘤细胞

细胞培养技术正常细胞培养

人或动物体外培养都不易，建立细胞系更难。原因：是分化细胞；生存条件严格；目前没有模拟与体内完全一样的方法；只要一切条件适当时仍有培养成功的可能；初代比传代容易。细胞培养技术体外培养的上皮组织基本特点

来源：外、内、中三个胚层。特征：细胞排列密集，易形成膜状呈贴壁性生长。细胞常相互黏附，具有生长的接触性抑制现象。

上皮组织细胞的结构和功能同样表现出极性。细胞的增殖和分化依赖于促细胞生长因子的作用。上皮细胞的特殊结构，如微绒毛、紧密连接、桥粒等，在培养细胞中也可见到。

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上皮组织的细胞培养条件要求比较高，常需生长在特殊的生长基质，极易失去在体内巳有的分化特征，如细胞极性等。注意：不仅保证上皮细胞在体外的生长和繁殖；而且应尽可能地恢复和诱导上皮细胞在体外培养状态下的分化。这也是上皮组织体外培养成功与否的关键。

细胞培养技术上皮细胞体外培养的特殊条件

(1)防范微生物污染：根据上皮组织分布的特性，位于体表或衬贴消化道、呼吸道内等处的上皮组织，直接暴露或同外环境相接触，组织本身带有各种病原微生物或受其污染的机会较多。细胞培养技术要求在组织取材时就严格灭菌；分离、种植、培养等诸多操作步骤上都要设法消除可能会出现的微生物污染。培养中所使用的各种液体，包括细胞保存液、分离液以及培养基等需添加抗生素，抗生素浓度比其它组织培养高。

细胞培养技术(2)生长基质的支持：上皮细胞依赖贴附于某种支持物上才能生长，即所谓的贴壁依赖性细胞。在培养器皿表面包被生长基质，如胶原或其它细胞外基质成分等，模拟体内的基膜结构，不仅特别有利于上皮细胞的贴附和生长，也有利于培养细胞的分化．使细胞极性表现更为明显。细胞培养技术(3)特殊的培养基：培养基有M199、RPMl1640、DMEM和HamFl2。其中以M199和RPMl1640较为常用。M199和RPMI1640培养基仅适用于上皮组织的短期培养和维持其生存，对上皮组织的长期培养和促增殖作用并不明显。M199和RPMl1640细胞培养技术DMEM和HamFl2培养基用于上皮组织培养时有其特殊作用。可促进上皮细胞的贴附；维持上皮细胞在体外培养状态的分化。DMEM和HamFl2细胞培养技术特别适用原代上皮细胞的培养，培养基成分中添加微量元素的无机离子，更加利于细胞的生长和代谢。在实际培养时，将DMEM与HamFl2按一定比例混合用于上皮组织培养。加入血清，但出厂血清成分复杂，含有一定量的有毒物和抑制物。HamFl2培养基的特殊性细胞培养技术无血清培养基：在培养基中主要添加了各种促细胞生长因子，甚至还添加大鼠颌下腺或脑垂体的粗提物；以促进细胞的生长和增殖。无血清培养基对细胞也有良好的促生长作用，但仍需完善和改进。无血清培养基细胞培养技术(4)去除成纤维细胞：上皮组织借薄层基膜和结缔组织相连。取材分离细胞时会带入少量结缔组织成分，常常造成成纤维细胞与上皮细胞混和生长。由于成纤维细胞具有增殖能力和粘附能力强的特点，很容易“疯长”为培养物中的优势细胞群，从而干扰或抑制上皮细胞的生长，成为上皮细胞的“细胞污染源”。

成纤维细胞>上皮细胞细胞培养技术

因在上皮细胞的取材、分离、、种植和传代的培养过程中，要特别注意上皮细胞的纯化，去除和抑制成纤维细胞的生长。

细胞培养技术内皮细胞：来源：人脐带脐静脉，动物动脉消化：用胶原酶比胰蛋白酶消化好。但要注意掌握消化时间和杂细胞（成纤维细胞和平滑肌细胞）。细胞培养技术

如消化时间过长或操作不慎、刮取过重时，会造成血管内皮下层与外膜成纤维细胞以及中膜平滑肌细胞污染。由于这些杂细胞生长较快，随着传代次数越多，其污染的程度越重，从而使培养失败。介绍排除杂细胞的方法：细胞培养技术①传代时加酶液后，镜下观察1--2mln可见大部分内皮细胞收缩变圆，而