转基因植物教学教案

利用培养的植物细胞生产次生物质

植物细胞不仅具有形态建成的全能性，还具有物质代谢的全能性，通过药用植物细胞或组织的大量培养，可以获得某些有用成分，特别是用化学手段合成困难的药物。目前通过组织培养成细胞培养的药用成分有生物碱，甙类、甾醇，萜稀类、醌类、木质素类、黄酮类、糖类、蛋白类、有机酸类、芳香油、酚类等上百种。培养物中药用成分产量超过1%干重的药用植物已有几十种之多。3.1培养基的选择

对细胞培养来说不同的培养基往往使细胞产率和所需的次生产物的产率都不同。例如，用不同的培养基长春花细胞悬浮培养物，在细胞产率和蛇根碱的产率上场产生不同的结果，且适合于细胞生长的培养基不一定有利于次生物的生产。另外，降低培养基的成本也是研究的重要方面。3.2细胞株的选择

植物的根、茎、叶、花、果实、种子、髓等组织或器官都可用来诱导愈伤组织，在实际工作中往往是在生长活跃的部位取材，进行愈伤组织的培养，此时可以进行各种培养基的选择，经过一段时间的培养，可以选择出适当的培养基作为以后培养的基本培养基。等愈伤组织长大后，转移到液体培养基中进行振荡，分离细胞。一般愈伤组织不会很好地分散成理想的单细胞悬浮液，大多为50—200个细胞组成的细胞团。：3.3培养方式和培养容器

小规模培养可选择大小适当的三角瓶（50—2000ml），里面有选定的培养基，把筛选好的细胞株接入以后，转旋培养（60—150转/min）,4周后可进行继代培养。若采用固体培养，在培养基中加入0.7-0.9%琼脂。大规模培养方式主要是液体悬浮培养法，培养容器用桨式搅拌罐、空气提升式反应器。3.4提高次代谢产物产量的方式

3.4.1选育高产稳定细胞株在药用植物组织培养中，细胞株不移稳定，有效成分含量在继代中会逐渐降低，此外许多药用成分含量太少，不利于工业化生产。因此，首先要建立快速检测产物含量的检测系统，检测一个个细胞团，从中找出高产细胞株，将高产量的细胞株继续培养，从中再找出更高产量和更稳定的细胞株，如此反复筛选，最终选育出高产稳定细胞株。还有一个常用的方法是使植物细胞发生突变。由于突变有可能造成某些和次生代谢有关的基因缺失，如某一抑制基因缺失，从而解除了对代谢过程的抑制，使产物量大大增加；或某一些代谢基因的缺失造成某种中间产物的积累。常用的使细胞发生突变的方法包括用紫外线、γ-射线及X-射线的照射，或用化学诱变剂，如5-溴尿嘧啶，甲基磺酸乙酯等。3.4.2培养液中加入诱导子，增加有效成份含量诱导子可以是高压灭活的真菌，细菌和酵母的细胞壁萃取物，滤液或孢子等生物诱导子，也可以是重金属，砜酸盐和阿魏酸，苯甲酸等人工合成的化合物，如悬浮培养的西洋参细胞经刺盘孢菌丝状体诱导子处理后，总皂甙产率可由对照的296mg/L增加到679mg/L（约总细胞干重的16.3%）。3.4.3建立适宜的培养程序和条件，保证细胞系高产稳定

a二步法从许多植物细胞培养与次生产物的形成来看，生物合成作用往往在细胞生长的后期，据此提出二步培养发（two-stepculture）。第一步培养基称为生长培养基，主要适合于细胞的生长；第二步称为生产培养基，用于次生产物的合成。两种培养基往往有所区别，后者通常具有较低含量的硝酸盐或磷酸盐，或两者含量均较低。此外，通常也含有较低的糖分或少量可利用的碳源。二步培养已在许多药用植物细胞培养中得到应用。日本首次利用紫草细胞工业化生产紫草宁用二步法。Mei等（1996）在10L反应器中采用二步培养技术培养红豆杉细胞，20天后生物增加了3倍，经过比较，生长基中紫杉醇含量很低（0.8mg/L），生产基中达19.4—27.5mg/L。b固定化培养将悬浮培养的植物细胞包埋于固体基质中，成为一个固定的生物反映系统。包埋的基质：多糖和多聚化合物，如褐藻酸盐、琼脂（糖）、聚丙烯酰胺、角叉莱胶。由于这些支持物胶体本身的交联方式，使之对养料、水分及气体有一定的通透性，在不同程度上维持细胞的生物活力，从而得证进行生化反映的酶系和辅助因子的存在。基于此原理，在细胞产生次生产物的时期，就将其固定化，加以营养介质及底物进行反应，将其制成颗粒状，注入柱式反应器，就可以进行连续循环反应。通过固定化细胞进行连续培养始实现商业化生产的有效途径。C代谢产物胞外释放由于大部分有用的次生代谢物并不释放到培养基中，而是储存于液泡中，传统的提取药用次生代谢物的方法始破碎细胞，使细胞只能一次性的使用。解决储存液泡中的次生代谢物使之释放到胞外也是通过固定化细胞进行连续培养要解决的一个主要问题。已发展出了化学试剂法、改变离子强度法、PH扰动法、电击法等。D两相培养技术（two-phaseculture）即在培养基中引入第二相，细胞产物在原培养系统合成后，向第二相富集，从而减了产物的反馈抑制，不仅提高了产物，而且简化了后处理。3.4.4药用成分生物合成途径及关键酶

研究植物次生代谢合成途径对提高次生代谢物产量很有帮助。可以通过添加产物的前体或添加副产物使细胞内合成有利于产物方向从而提高产量。其次，药用植物次生代谢产物的形成总是与连接初生和次生代谢酶的活性成正相关，因此分离编码这些酶的基因，通过Ti质粒和Ri质粒载体携带克隆基因等到植物细胞中，可提高该酶的表达量，酶活总量提高，次生物量也响应增加。3.4.5发根培养技术

发根农杆菌含有诱导长根的Ri质粒，和Ti质粒一样，Ri质粒与转化相关的也有两个区，Vir区和T-DNA区。发根农杆菌感染植物伤口，经一周到数周后出现毛状根，毛状根没有向地性，除菌后在无生长激素的培养基上培养，可迅速生长并产生许多分枝，其生长速度一个月可增殖几百倍。发根生长快，培养条件简单，无需要外源激素、次生合成能力较稳定;而且发根来源于单细胞，便于突变体的筛选；发根是有一定分化水平的器官，能合成某些悬浮细胞不能合成的次生物质，也就是亲本植物株能合成的次生代谢物都可用发根培养物来生产。有许多药用植物发根培养取得成功。如人参，紫草等。发根培养生长迅速，不便采用固定培养，一般采用液体培养或大规模发酵培养。Figure1.Intheprocessofcausingcrowngalldisease,thebacteriumAgrobacteriumtumefaciensinsertsapartofitsTiplasmid—aregioncalled

T-DNA—intoachromosomeofthehostplant.Figure2.SimplifiedrepresentationofthemajorregionsoftheTiplasmidofA.tumefaciens.TheT-DNA,wheninsertedintothechromosomalDNAofthehostplant,directsthesynthesisofnopaline,whichisthenutilizedbythebacteriumforitsownpurposes.T-DNAalsodirectstheplantcelltodivideinanuncontrolledmanner,producingatumor.StructureofTi-plasmidT-DNA区毒性区(Vir-region,vir)质粒复制起点(Originofreplication,ori)质粒结合转移位点

(Transferfunctionsite,tra)冠瘿碱分解位点(ocsornos)土壤农杆菌-植物DNA转移体系步骤植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用土壤农杆菌的毒性区基因被激活T-DNA的切割和T复合物生成T复合物由土壤农杆菌经植物细胞膜进入植物细胞T-DNA整合到植物染色体上Figure1.Intheprocessofcausingcrowngalldisease,thebacteriumAgrobacteriumtumefaciensinsertsapartofitsTiplasmid—aregioncalled

T-DNA—intoachromosomeofthehostplant.InteractionofAgrobacteriumTi-plasmidDNAandplantcells

植物敏感细胞和土壤农杆菌相互作用植物受伤产生大量对土壤农杆菌感染敏感的细胞受伤细胞产生一些低分子量的酚类物质可明显刺激土壤农杆菌Ti质粒上毒性区表达乙酰丁香酮（AS），α-羟基乙酰丁香酮Ti质粒毒性区基因激活及

T-DNA复合物生成InsertpictureIntegrationofT-DNAintothechromosomeofhostplant

T-DNA整合到植物染色体上首先在植物靶DNA上出现一个缺刻(nick)随着DNA解链，宿主细胞的5’—3’外切酶活性使缺刻扩大成裂口(gap)T-DNA侵入裂口，末端与靶DNA单链上的少数核苷酸配对形成异源二倍体；T-DNA悬挂在外侧的末端被切割除去，T-DNA与靶DNA末端相连；靶DNA上链出现缺刻，以整合后的T-DNA下链为模板合成T-DNA的第二条链，完成整合过程。4利用根癌农杆菌Ti质粒可将药用基因转入植物

根癌农杆菌是一种土壤细菌，它可以在植物伤口处诱导植物产生肿瘤，并在肿瘤组织中大量合成冠瘿碱（章碱和胭脂碱）作为菌株生存的唯一碳源和氮源。后来用分子杂交技术证明植物肿瘤细胞中存在一段外来DNA，经鉴定是来自农杆菌质粒(Ti)上的一段DNA，因为它可转移，称之为T-DNA。因此，可以将T-DNA的转移看作一种天然存在的转基因形式。将其加以改造，可以将所需的目的基因导入植物，利用植物体产生我们所需的产品。实际上目前的转基因植物大多数是利用这一机理实现的。4.1Ti质粒结构与T-DNA的转移

Ti质粒有两个区域与T-DNA转移有关：1、Vir区含有VirA-----VirH等8个操纵子，共24个基因，这些基因可被受伤植物组织的渗出物激活。渗出物可诱使细菌趋向植物细胞，这也是T-DNA转移所必须的。VirA为膜蛋白，可被植物受损的组织渗出的乙酰丁香酮（AS）所激活，激活的VirA再激活已存在的VirG蛋白，VirG是其他Vir基因转录的激活因子，VirG激活VirB、C、D、E、H等基因，使其转录和表达。表达的VirD1首先与25bp边界序列结合，改变边界序列的构象，VirD2特异剪切并和5端共价结合，并有导向作用。VirC可促进剪切。VirE2是单链DNA结合蛋白。VirB有11个基因，是一些膜通道蛋白，可以将单链T-DNA运输出细菌及进入植物细胞细胞核。2、T-DNA区：T-DNA双链都编码基因，编码基因主要和致瘤有关。如生长素合成基因，还有合成冠瘿碱的基因，大约有十几个基因。5’和3’端都有真核表达信号，如TATA框,polyA，所以可以在真核细胞中表达。T-DNA左右边界具有25bp的重复序列，特别是右边界，如缺失则T-DNA不能转移。因此边界序列对转移及整合非常重要。转移与区域的其他基因无关，所以可以去除致瘤基因和插入外源目的基因。4.2Ti质粒的改造及表达载体的建立

由于Ti质粒太大（160—240kb），酶切位点太多，不能进行体外重组，而且有onc基因，对植物有致瘤作用，因此需要对Ti质粒进行改造。如切除T-DNA上致瘤基因而由大肠杆菌的PBR322代替；去除Ti上那些基因对T-DNA的转移不起作用的基因。现在构建的载体一般为双元载体，即包括两个Ti质粒，微型Ti质粒和辅助Ti质粒。微型Ti质粒含有T-DNA边界而缺失Vir基因的Ti质粒，除T-DNA左右边界外，中间有可供外源基因插入的多可隆位点；还具有广谱的复制位点及选择标记基因；它既可在农杆菌中复制，又可以在大肠杆菌中复制。辅助质粒是T-DNA缺失的突变型Ti质粒，为微型Ti质粒提供Vir基因功能，这个质粒存在于农杆菌中。可以将纯化的微型Ti质粒直接转化速冻的农杆菌感受态细胞；也可以通过三亲杂交转移法，即将含有协助质粒的大肠杆菌、含有微型Ti质粒的大肠杆菌和含有受体Ti的农杆菌三种细胞混合培养，通过含协助质粒的大肠杆菌的帮助将微型Ti质粒导入到含有辅助质粒的农杆菌中。4.2根癌农杆菌转化植物用打孔器从消毒叶片上取得叶圆片，在过夜培养的对数期的已构建好的农杆菌工程菌的菌液中浸数秒后，置于培养基上共培养2-3天，待菌株在叶盘周围生长至肉眼可见菌落时再转移到含有抑菌剂的培养基中除去农杆菌，与此同时该培养基中加入抗生素进行转化体筛选，经合适的培养基培养得到愈伤组织，再得到再生植株。4.3植物医药基因工程大部分医用蛋白的传统生产方法是从动物和人体组织中提取或用动物细胞进行基因工程生产。如中国仓鼠卵巢细胞（CHO）细胞生产蛋白质，成本高，价格昂贵。原核表达系统虽然廉价方便，但缺少翻译后加工系统，所生产的蛋白质种类有限。植物作为真核系统，对所表达的蛋白的各种翻译后加工与动物系统相似，从而较好的保留了其生产的动物细胞来源的蛋白的生物活性。还有避免动物病原体的感染及方便产品的储存与运输等优点。因此，植物表达系统生产药用蛋白已经引起越来越多人的注意。现已有上百种重要的医用蛋白，如人表皮因子、胰岛素、巨嗤细胞集落利激因子（GM-CSF）脑啡肽、干扰素、人血清白蛋白、水蛭素及多种抗体与疫苗都已在植物成功表达。4.3.1用植物生物反应器生产疫苗

用植物生物反应器生产疫苗是当今研究的一个热点。许多病毒抗原与细菌抗原基因已成功转入植物，并表达出有免疫活性的产物。已表达的病毒抗原有：乙肝病毒表面抗原（HBSAg），狂犬病毒（Rv），表面糖蛋白，如NorwalkVirus（NV）的衣壳Pr，口蹄疫病毒（FMDV）的VP蛋白等，NorkalkVirus的衣壳蛋白已在烟草和马铃薯中表达，给小鼠喂饲从烟草中提纯的NV衣壳蛋白或表达NV衣壳的马铃块状茎，都可以引起小鼠体液抗体的产生，转入NV衣壳蛋白的马铃薯的人体口服临床实验正在进行中。4.3.2用植物生物反应器生产抗体

以CaMV35S为启动子，将抗体的重链基因和轻链基因分别转化烟草，分别得到表达重链和轻链的转基因植物，然后将两者杂交，获得表达完整抗体的植物，所表达的抗体占总叶蛋白的1.3%。因植物可直接食用，可省去繁琐的提纯过程，而且非常廉价。据估计，普通的方法生产1g抗体成本为2000-5000美元，而用转基因黄豆生产1000g抗体只需100美元。4.3.3用植物生物反应器生产次生代谢产物

将长春花编码色氨酸脱羧酶导入烟草，使之以色氨酸产生生物碱色胺，在转基因植物中该酶活性增加了15倍，而色胺的含量增加了260倍。聚-羟基丁酸（PHB）始多种细菌在环境胁迫条件下产生的一种贮能物质。PHB具有热塑料及合成橡胶的特性，而且多种微生物都可将它降解为对环境无害的产物，所以它作为一种生物可降解塑料受到人们的关注。乙酰辅酶A是细菌中PHB合成以及植物贮存油脂生物合成的前体。将从细菌中克隆的PHB和PHC基因（分别编码NADPHD的乙酰CoA还原酶和PHB合成酶）等导入拟南芥，可产生PHB，干重可高达14%。根癌农杆菌Ti质粒介导基因转化一、植物基因的分离1.选用适当的植物基因启动子2.启动子的组织特异性和局限性3.启动子的表达条件光、温度二、植物基因工程载体的构建美国孟山都（Monsanto)英国PBI(植物育种研究所）美国PGEL(植物基因工程实验室）比利时Gent实验室三、植物基因转移到植物细胞的方法1.DNA直接导入法PEG法电击穿孔法微弹射击法直接注射法2.载体法Ti质粒介导基因转化（双子叶植物）脂质体病毒（花椰菜花叶病毒）四、转基因植物细胞的组织培养叶盘法（多种双子叶植物）DNA的直接转移法（单子叶植物）五、基因转化后植物细胞的选择与转基因植物的鉴定1.抗生素选择法2.除草剂选择法胭脂碱合成酶基因报道基因（氯霉素乙酰基转移酶基因CAT、GUS基因、荧光素酶基因)检测六、转基因植物的应用1.抗除草剂基因工程2.抗虫基因工程3.抗病毒基因工程4抗菌基因工程5.抗逆基因工程6.改变花色7.植物医药基因工程A.用植物生物反应器生产疫苗B.用植物生物反应器生产抗体8.次生代谢产物基因工程转基因技术转基因技术，一个可以改变我们生活的东西，正一天天向我们靠近，令我们产生无限的遐想。然而，它又是一把双刃剑，它所存在的隐患也是巨大的。让我们一起关注——转基因技术。

科学家为了改变某些动植物产品的品质或为提高其产量，把一种生物的基因转到另一种生物上去，叫作转基因。以转基因生物为原料加工生产的食品就是转基因食品。例如，在西红柿里插入某种细菌的基因，可以使西红柿花成熟的时候果体比较硬，便于储运、加工；给玉米插入抗虫害基因，可增强其抗虫害能力（例如，美国培植的一种认Bt的玉米，其内含有毒素，这种毒素能够杀死欧洲玉米螟）等等。因为这些东西都是人为的，对人体及食物链是否有害，目前尚无定论，须经长时间的实践检验才可得出正确结论。

近几年来，全世界转基因作物种植发展迅速，1999年达到4000万公顷，仅美国、加拿大、阿根廷三个国家就占其中的99％；此外，中国、埃及、南非、印度和巴西也有一定量的种植。主要品种有：抵抗昆虫的玉米、抵抗杀虫剂的大豆、抵抗病害的棉花、富含胡萝卜素的水稻、耐寒抗旱的小麦、抵抗病毒的瓜类和控制成熟速度及硬度的西红柿等。据国际农业生物工程应用技术采购管理处今年2月公布的数字表明，中国转基因作物种植面积发展很快，2006年比1989年增加了800倍，达到600万公顷，主要是棉花等。

关于转基因的种种忧虑

人们对于转基因生物和转基因食品的忧虑主要有两个方面，一是对人体健康是否有害，一是对生态环境是否构成潜在威胁。

联合国粮农组织指出，随着传统的栽培品种逐渐被少数转基因品种所取代，生物的多样性有可能会慢慢消失；另一方面，可能会引起"异型杂交"--植物之间交叉授粉，导致出现抗病能力特强、蔓生速度更快的杂草，从而扰乱生态系统的平衡。对于人体，基因的某种转移也许会产生新的毒素和过敏原，引起意想不到的中毒或过敏反应。例如，一些科学家发现，转基因食品可令肝脏发大；英国科学家普斯陶伊实验，连续喂食老鼠基因改良土豆，发现部分老鼠的肾、脾。大脑等器官收缩或发育不正常，免疫系统变弱，等等。

还有一种忧虑是经济方面的。印度的一些专家指出，六家大公司控制着这种技术，他们所做的并不是设法为第三世界创造出增加产量的作物，实际关注的是商业利益，并利用转基因种子和作物的专利权把发展中国家的农民逼入困境。

由于欧洲公众的抵制，今年美国不得不减少转基因作物材种植，其中转基因棉花和玉米面积各减少8％，转基因大豆面积减少5％。

其实，转基因技术是人类的一道曙光，无论带来怎样的后果，转基因技术的出现都是科学技术发展的必然，其势不可阻挡。就像人类发现并利用原子能一样，可以和平利用，造福人类，亦可制成杀人武器，致祸世界。墨西哥国家科学院院长指出："各种技术都有被滥用的可能，就像用一把切肉的刀去杀人。我们难道因此就禁止用刀吗？"什么是转基因技术？

所谓转基因技术，就是采用某种技术将人工分离或修饰过的基因等外源生物的基因导入到目标生物体基因组中，通过导入基因的表达，引起目标生物体性状可遗传性的改变。遗传工程、基因工程、遗传转化均为转基因的同义词。这样获得的生物体成为转基因生物。目前在动物、植物和微生物体上都可以成功地进行转基因操作。但由于目标生物体的门类不同，所采用的主要技术也各有不同。

转基因技术带来的好处也是显而易见的，第一，通过此项技术可以改良品种。例如，培养对地力消耗较少又抗倒伏的矮秆作物和抗干旱、耐盐碱、抗重金属且产量高的品种，从而在有限的耕地上生产出更多的粮食，以舒缓因人口不断膨胀所造成的食物短缺问题。第二，可以延长食品保存时间及增加营养成分。例如瑞士科学家培育出的一种富含p胡萝十素的水稻新品种--"黄金水稻"，可望结束发展中国家人口维生素A摄入量不足的状况（注：P胡萝卜素是形成维生素A的基础材料，维生素A缺乏症是导致发展中国家千百万儿童失明和罹患其他疾病的常见原因）。第三，通过给作物加入防虫防菌基因，使作物本身产生抵抗病虫害侵袭的能力，因而可减少农药的使用量，有利于环境保护。例如加拿大，2006年农药使用量减少了60％。第四，转基因技术及基因食物目前正向医疗药用方面扩展。例如，目前的抗痢疾治疗成本高，科学家已开始研究将有关因子植入香蕉内，制成口服疫苗。如此等等。

对于转基因技术及转基因食品，只要理性对待，兴利除弊，它的前景是十分光明的。转基因食品的由来

所谓转基因食品，就是利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到其它物种中去，改造生物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质方面向人类所需要的目标转变，以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品就是转基因食品。它的研究已有几十年的历史，但真正的商业化是近十年的事。90年代初，市场上第一个转基因食品出现在美国，是一种保鲜番茄，这项研究成果本是在英国研究成功的，但英国人没敢将其商业化，美国人便成了第一个吃螃蟹的人，让保守的英国人后悔不迭。自转基因食品问世十几年来，全球约有20亿多人食用过数千种转基因食品，尚未报道过一例食品安全事件。但国外曾发现有少数几种可导致实验动物过敏，因而停止其商品化生产。转基因食品的研制目前只有动物实验，而无人体试验或长期观察。

转基因食品一发不可收。据统计，美国食品和药物管理局确定的转基因品种已有93种。美国是转基因食品最多的国家，60％以上的加工食品含有转基因成分，90％以上的大豆、50％以上的玉米、小麦是转基因的。转基因食品有转基因植物，如：西红柿、土豆、玉米等，还有转基因动物，如：鱼、牛、羊等。虽然转基因食品与普通食品在口感上没有多大差别，但转基因的植物、动物有明显的优势：优质高产、抗虫、抗病毒、抗除草剂、改良品质、抗逆境生存等。转基因食品的安全问题

面对越来越多的转基因食品，人们的认识并非一致，以美国为首的主吃派和欧洲为首的反对派在全球范围内形成了两大阵营。不久前调查表明，美国、加拿大两国的消费者大多已接受了转基因食品，仅有27％的消费者认为食用转基因食品可能会对健康造成危害。而在欧洲，大多数人是反对转基因食品的，英国尤为明显。缘由是1998年英国的一位教授的研究表明，幼鼠食用转基因的土豆后，会使内脏和免疫系统受损，这是对转基因食品提出的最早质疑，并在英国及全世界引发了关于转基因食品安全性的大讨论。虽然英国皇家学会于1999年5月发表声明：此项研究“充满漏洞”，得出转基因土豆有害生物健康的结论完全不足为凭。但是，转基因食品的安全性问题已引起了消费者的怀疑。79％的英国人反对试种基因改良作物，抵制转基因食品进入市场。转基因食品前景乐观

虽然对于转基因食品还存在这样那样的争论，但它的优势还是表现得越来越显著。在美国得到普遍种植的转基因玉米中色氨酸含量提高了20％。色氨酸是人体必需的氨基酸