大豆品种抗病性鉴定技术规范

1主题内容和适用范围本规范规定了大豆品种胞囊线虫病抗性鉴定技术和抗病性评价标准。本规范适用于安徽省主要农作物品种审定中大豆胞囊线虫病抗性鉴定和抗性评价。本规范同时适用于安徽省大豆品种区域试验、生产试验和自然诱发鉴定中大豆胞囊线虫病病情调查和抗性评价。3术语和定义3.1大豆胞囊线虫病SoybeanCystNamatode由大豆异皮线虫(HeteroderaglycinesIchinche)所引起的以叶部黄化和植株矮化症状为主的大豆线虫病害。3.2对照品种本规范中特指为检验试验的可靠性，在品种鉴定时附加的在特定生态区表现为已知抗病程度的抗病品种（Peking）或感病品种（Lee）。3.3胞囊指数通过对植株个体根部着生胞囊数值的综合计算所获得的群体发病程度的数值化描述形式。4、病原物4.1病原物来源在安徽大豆产区的不同生态区采集大豆胞囊线虫，按生理小种（群）建立菌种库。4.2接种体接种体一般为单个生理小种，或淮北、江淮丘陵、沿江等生态区内不同生理小种的混合菌种，一般根据委托单位要求从菌种库中制备。没有特定要求的情况下，接种体为菌种库中最新的病原物。4.3．供试大豆胞囊线虫繁殖（用有胞囊的土壤繁殖）采集的土壤胞囊线虫密度在30个胞囊/100克土壤或60个卵/克土壤时可以直接进行抗性鉴定。如果线虫量低于以上标准，要种植多个感病品种进行1代的扩繁。4.4大豆胞囊线虫卵的分离和卵悬浮液配备通过漂浮过筛法进行胞囊分离，获得的胞囊采用组织细胞匀浆器破碎胞囊后过200目网筛后在500目网筛下收集卵，并配成200粒卵/ml的卵悬浮液。5鉴定圃5.1选择在有较好生态代表性的试验基地建立胞囊分布均匀的田间病圃，具体条件符合4.3规定。5.2自然诱发鉴定试验圃应当选择在淮北、江淮丘陵、沿江等生态区内大豆生产集中产区。5.3鉴定圃设计、种植和管理因鉴定方法不同而异，具体见6.1，6.2。6鉴定6.1田间病圃鉴定法6.1.1．种植方法选择符合要求的病圃，6月上中旬播种，每份材料种1行，行长2米，留苗15-20株，2次重复。鉴定品种中加入抗病或感病的对照品种。6.1.2．病情调查播种出苗后正常田间管理，播后第26-29天检测抗性对照品种根部的大豆胞囊线虫的发育情况，当大豆胞囊线虫白色的雌虫突出表皮时，即可进行挖查，调查记录每株大豆根上的白色胞囊的数量。挖查过晚或过早，调查结果都不准确。每个品种每次重复调查15株，共调查30株。病情调查记载表格式见附录A，附录A-1.A-2由鉴定单位自行选择一种。6.2人工接种（盆栽）鉴定法6.2.1供试土壤采用无线虫胞囊的土壤，按2：1的比例混入细纱装入花盆或薄塑料杯备用。6.2.2．接种方法鉴定在温室中进行，将装入花盆或薄塑料杯备用的土壤浇透水后，每个用铅笔或木棍在花盆或薄塑料杯的对称处扎两个小孔，将供试鉴别寄主大豆品种催芽后待根长出1cm左右时挑选均匀的豆苗，播入小孔中，每个孔中浇灌（含200粒卵/ml）5ml卵悬浮液后覆土封盖后培养。每品种播种20株，25℃下正常管理。每次加10株感病对照品种。如果在塑料杯中鉴定，每杯种1株，接种（含200粒卵/ml）5ml卵悬浮液。6.2.3病情调查播种25天后检测感病品种根部的大豆胞囊线虫的发育情况，当大豆胞囊线虫白色的雌虫突出表皮时，即可进行扣盆调查记录每株大豆根上的白色胞囊的数量。每个品种调查20株。病情调查记载表格式见附录A，附录A-1.A-2由鉴定单位自行选择一种。6.2.4鉴定调查记载表要有鉴定人员和复核人员签字。在开展鉴定调查时，鉴定人员与复核人员一同进行，鉴定人员对鉴定植株病情级别进行判断，经复核人员确认后记载。6.3抗性分离现象记载若一个鉴定群体中出现明显的抗、感类型，应在调查表中注明“抗性分离”。用/表示。6.4一般只选择6.1或6.2中一种方法进行鉴定。如果选用2种方法鉴定，鉴定单位要对鉴定结果进行综合评定。7抗性评价71抗性类别划分标准7.1.1田间病圃鉴定法抗性类别划分标准（表1）7.1.2盆栽鉴定法抗性类别划分标准（表2-南京农业大学用标准）胞囊指数保留1位小数。表1田间病圃鉴定法抗性类别划分标准抗性级别根系平均胞囊数量抗性类别缩写类别10I免疫30.1-3.0R抗53.1-10.0MR中抗710.1-30.0S感9＞30HS高感表2盆栽鉴定法抗性类别划分标准抗性级别胞囊指数%抗性类别缩写类别10I免疫30.1-15R抗515.1-40MR中抗740.1-70S感9>70HS高感7.2有效性判别采用田间病圃鉴定法鉴定的，对照感病品种或鉴定对象中有任一品种的抗性级别达到7-9的，该批次鉴定有效；采用人工接种（盆栽）鉴定法鉴定的，对照感病品种或鉴定对象中有任一品种的根系胞囊数量达到在30个以上的，该批次鉴定有效。7.3重复鉴定同一鉴定品种的抗性级别一年为5，另一年在5以下或5以上的，如果两年抗性级别相差2个级别以上（包括2个级别）的，则需要做第三次抗性鉴定。或一年在5以上，另一年在5以下的，则需要做第三次抗性鉴定。7.4抗性评价7.4.1在有3年鉴定的结果中，如有2年的抗性类别是一致的，则此抗性类别作为最终鉴定结论。7.4.2达到免疫-抗或感-高感类别的鉴定品种，当两年抗性类别不一致时，以记载的最高根系胞囊数量或胞囊指数所对应的抗性类别为准。7.4.3同一鉴定品种的抗性级别一年为5级，一年在5以下或5以上的，如果两年抗性级别相差1个等级，用两年根系平均胞囊数量或胞囊指数的平均数，对照7.1标准重新划分抗性类别；如果两年抗性级别相差2个级别以上（包括2个级别）的，则需要做第三次抗性鉴定，与相差1个等级的根系平均胞囊数量或胞囊指数平均，重新划分抗性类别，或在其他情况下直接用3次鉴定的根系胞囊数量或胞囊指数平均，重新划分抗性类别。7.4.4同一鉴定品种的抗性级别一年在5以上，另一年在5以下的,则需要做第三次抗性鉴定，按7.4.1～7.4.3规则重新划分抗性类别。3术语和定义3.1大豆花叶病毒病soybeanmosaicvirus由大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus，SMV)所引起的以叶部花叶、皱缩和植株矮化症状为主的大豆病毒病害。3.2对照品种checkvariety本规范中特指为检验试验的可靠性，在品种鉴定时附加的抗病品种（诱变30）和感病品种（南农1138-2）。4病原物4.1病原物来源在安徽大豆产区的不同生态区采集由SMV侵染引起的大豆花叶病病叶，按病毒株系建立菌种库。4.2接种体接种体一般为单个SMV株系，或特定生态区内不同SMV病叶的混合病原物，一般根据委托单位要求从菌种库中制备。没有特定要求的情况下，接种体为菌种库中最新的病原物。5鉴定圃5.1选择在有较好生态代表性的试验基地建立田间病圃。5.2自然诱发鉴定试验圃应当选择在淮北、江淮丘陵、沿江等生态区内大豆生产集中产区。5.3鉴定圃设计、种植和管理因鉴定方法不同而异，随机区组排列，具体见6.1，6.2。大豆生育前期不灭蚜，依靠蚜虫传毒造成发病。6鉴定6.1田间病圃自然诱发鉴定法6.1.1选择符合要求的鉴定圃，在比较接近生产的条件下进行鉴定，鉴定品种数目适当。6.1.2一般采用人工摩擦接种与自然诱发相结合的方法。发病前期蚜虫发生较少时，可用人工汁液摩擦接种。6.1.3在病圃中，每个鉴定品种种植一行，每行种植25-30粒种子，行距为50cm，出苗后间苗，保证一定株距。每隔10行各种植1行抗病和感病对照品种，2次重复。6.1.4出苗后检苗，拔除种传毒苗。当幼苗长出第1片复叶时，把带毒的蚜虫移至复叶上。为了保证传毒效果，在大豆开花前不施药灭蚜虫。由于整个大豆生长期间蚜虫不断的繁殖和传播病毒，被鉴定的大豆材料容易被病毒侵染。田间病圃鉴定，由于病毒为田间混合群体，难以反映被鉴定大豆材料对单一病毒株系的抗病性。田间病圃鉴定受自然环境影响较大，发病程度不稳定，只能作为辅助鉴定。6.2人工接种鉴定法6.2.1．准备工作⑴整个接种试验在防虫温室或网室中进行。⑵种植材料基质用沙或沙：壤土（1：1）。接种前，研钵、研棒用洗洁剂洗净，放入微波炉中处理3分钟，接种刷（即油画笔）用洗洁剂洗净后，在紫外灯下照射半小时，避免不同病毒、株系的交叉感染。选用600目金刚砂，配制0.1MpH7.5的磷酸缓冲液（配方：Na2HPO4•12H2O71.6g和KH2PO4•12H2O6.8g，加纯净水2400ml搅拌使其溶解，调pH到7.3-7.5，定容到2500ml）备用。⑶网室中毒源繁殖和保存期间，定期喷药杀灭蚜虫，以保证试验毒源的纯度。⑷接种体制备。见4.2。⑸病毒的繁殖在防虫温室或网室内，采用盆栽种植感病品种（南农1138-2），出苗后检苗，淘汰种传毒苗，每盆留苗8～10株。将低温保存的SMV病叶在研钵中用少量0.1MpH7.5的磷酸缓冲液(1克新鲜病叶加3-5ml缓冲液)和600目金刚砂研碎，用接种刷蘸取汁液均匀摩擦接种于感病品种（南农1138-2）第一对充分展开的真叶上，接种后立即用清水冲洗叶片上多余的汁液。每接完一个病毒样本后，换一次性手套。发病的叶片装入无菌塑料袋放低温冰箱保存，或者隔3个月接种繁殖一次。6.2.2种植将鉴定品种条播种植在防虫网室中，每行种植25-50粒种子，行距为50cm，2次重复。防止叶片间摩擦传毒，检验苗后每行留苗15～30株，单株之间留5～10cm的间隙。6.2.3接种将在感病对照品种（南农1138-2）上繁殖的病样接种于第一对完全展开的真叶上。大约1周后，在第一片展开的复叶上进行第二次接种，以保证每一单株都被接上病毒。6.3病情调查6.3.1接种后30天内（接种后第20天观察一次，第30天复查一次）连续观察寄主的反应；逐株记载症状、病情级别。6.3.2按症状分别记载接种叶和上位叶的症状反应，系统花叶记为“M”；叶脉坏死、顶枯或枯斑均视为坏死，以“N”表示；无症状记为“0”。凡上位叶出现系统症状者为感病，每个感病单株根据分级标准划分为相应的级别。上位叶片无症状或只在接种叶上出现局部枯斑的为抗病。对无症状植株的参试品种进行再次播种，重复鉴定以进一步确认。6.3.3鉴定调查记载表要有鉴定人员和复核人员签字。在开展鉴定调查时，鉴定人员与复核人员一同进行，鉴定人员对鉴定植株病情级别进行判断，经复核人员确认后记载。6.4病情指数计算病情指数保留1位小数。6.5抗性分离记载若一个鉴定群体中出现明显的抗、感类型，应在调查表中注明“抗性分离”，用/表示。6.6病情级别划分标准个体按鉴定品种症状的严重度分级。一般将症状按花叶、坏死两种类型分别考虑，各分为5级。病害调查时，如在同一植株上同时出现花叶和坏死两种症状，病害级别取级别高者。单株病情严重度分级标准参照Zhi等（ZhiHaijian，2004中国农业科学）的方法：6.61花叶型（见图1）病情级别划分标准：病情级别症状0无症状或仅在接种叶上出现局部枯班1轻花叶2黄斑花叶、叶片轻度皱缩3重花叶、叶片皱缩卷曲4叶片严重皱缩且植株矮化6.62坏死型（见图2）病情级别划分标准：病情级别症状0无症状或仅在接种叶上出现局部枯班1部分叶片上出现可见微小坏死斑2多数坏死斑直径在5mm以下或有小叶脉坏死3坏死斑连片或坏死叶脉长度在20mm以上4叶片因坏死脱落，或坏死面积超过叶片总面积50%，或出现顶枯，不能继续生长7抗性评价7.1抗性类别划分标准抗性级别病情指数抗性类别缩写类别1＜10HR高抗310.1-30R抗530.1-50MR中抗750.1-70S感9＞70HS高感7.2有效性判别对照感病品种或任一鉴定品种的抗性级别达到7-9，该批次鉴定有效。7.3重复鉴定同一鉴定品种的抗性级别一年为5，另一年在5以下或5以上的，如果两年抗性级别相差2个级别以上（包括2个级别）的，则需要做第三次抗性鉴定。或一年在5以上，另一年在5以下的，则需要做第三次抗性鉴定。7.4抗性评价7.4.1在有3年鉴定的结果中，如有2年的抗性类别是一致的，则此抗性类别作为最终鉴定结论。7.4.2达到高抗-抗或感-高感类别的鉴定品种，当两年抗性类别不