DB50T 1006-2020 牛肺炎支原体抗体检测方法　

ICS11.220B43DB50Enzyme-linkerimmunosorbentassayForMycoplasma2020-05-20发布重庆市市场监督管理局发布DB50/T1006—2020本标准按GB/T1.1-2009进行起草。本标准由重庆市动物疫病预防控制中心提出。本标准由重庆市农业农村委员会归口。本标准起草人:蔺露、曾政、姚璐、董春霞、孙燕、谢建华、陈忠琼、凌洪权、梁望旺、杨泽林、程千川。DB50/T1006—2020牛肺炎支原体抗体检测方法本标准规定了牛肺炎支原体抗体检测方法，利用牛肺炎支原体抗体酶联免疫吸附试验，检测牛肺炎支原体抗体。本方法适用于检测牛血清（血浆）的牛肺炎支原体抗体。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的，凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T1.1-2009标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。牛肺炎支原体是指引起牛传染性支原体肺炎（又称烂肺病）以肺部病变为主要特征的传染病的一种支原体。3.2酶联免疫吸附试验简称酶联免疫法，或者ELISA法。将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，抗体与酶复合物结合，然后通过显色来检测。4牛肺炎支原体P39抗原酶联免疫吸附试验4.1试验材料洗液：配制见附录第A.1章；稀释液：配制见附录第A.2章；标准阳性血清：含牛肺炎支原体抗体的牛血清；标准阴性血清：无牛肺炎支原体抗体的牛血清；酶结合物：辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗牛IgG；底物溶液：配制参见附录第A.3-A.4章；终止液：配制参见附录第A.5章。4.2操作步骤4.2.1样品准备将被检血清（或血浆）用稀释液（见附录A.2）做1:40稀释。4.2.2加样取出抗原包被板，A1、B1加入100μL阴性对照，C1、D1加入100μL阳性对照，其余孔加入1:40稀释的被检血清（血浆），每孔100μL，将加样位置做好记录，用封膜封板，室温孵育30min。4.2.3洗涤1DB50/T1006—2020吸除孔内液体，每孔加300μL冲洗液（见附录A.1）冲洗，重复5次，在吸水纸上轻拍，确保孔内无残留液体。4.2.4加酶标抗体每孔加入酶标抗体液100μL，以封膜封板，室温孵育30min。4.2.5洗涤洗涤方法同4.2.3。4.2.6加底物每孔加入100μL底物使用液（见附录A.3和附录A.4），室温孵育10min。4.2.7终止加终止液（见附录A.5），100μL/孔，使其终止反应。4.3结果判定设定酶标仪检定波长在450nm（即OD值）；阳性对照均值（PC）＞0.5，阳性对照OD值的均值（PC）与阴性对照均值（NC）的比值＞4，判定实验有效，若两者不成立，则实验无效，需重复；待测样本的判定，S/P值≥0.4者判定为阳性，S/P值＜0.4为阴性样本。S/P=其中S为待测样本的OD值。2DB50/T1006—2020TMB(2mg/mL)底物缓冲液（pH5.5）9.5mL0.75%H2O2