病原生物与免疫学基础（第5版）课件 第十四章 病原生物学实训项目

病原生物学实训项目

1．熟悉显微镜的结构、功能和使用方法

2．掌握细菌的基本形态和特殊结构

3．掌握细菌生长现象

4．初步学会细菌接种法及无菌操作

5．验证微生物在自然界的分布

6．了解细菌涂片标本的制作与革兰染色实验目的1.微生物实验室规则介绍

2.显微镜的使用及保护方法

3.细菌形态观察（基本形态观察、特殊结构观察、革兰染色示教培养基的制备过程）

4.常用培养基介绍

5.细菌的接种法及无菌操作

6.细菌在培养基中生长现象观察

7.细菌的分布检查实验内容1．进入实验室前必须穿好白大衣，离室后脱下、反折。必要时配戴口罩。白大衣要勤洗换。

2．书包和衣物等不得带入实验室，必要的用具放在指定的位置。

3．实验室内严禁吸烟、饮食，以免感染。

4．保持实验室内安静，不得高声谈笑或随便走动，以利集中精力完成实验操作。

5．实验操作时，若不慎将传染标本、菌液等污染桌面，污染衣物、书本、手指及地面等意外事故，应立即报告带教老师，及时作出处理。微生物实验室规则介绍6．用过的吸管、滴管、试管和玻片等应放在指定的污物缸或盛有消毒液的搪瓷缸内，不得放在桌面上或水槽内，不得随便冲洗。

7．正确使用实验仪器，不得随意拨动电器开关等；节约实验材料，如损伤仪器或器材，应及时报告带教老师进行登记。

8．实验完毕后清理桌面，将需要培养的物品放入指定的培养箱或温室中。显微镜要擦干净后方可归还显微镜室，用过物品归还原处，并清洁和消毒桌面；洗手离开实验室，值日生要认真清扫实验室，关闭门、窗、水、电后方可离开实验室。微生物实验室规则介绍显微镜的使用及保护方法目镜物镜光源载物台载物台调节器细调节器粗调节器开关1、将显微镜放置在平整干净的实验台面上，镜座距离试验台面边缘3-4cm。

2、调节粗调节器，上旋载物台至最高，低倍镜观察，边观察边下旋，找到理想视野范围，在标本欲检部位滴1滴香柏油，然后转换成油镜。从侧面观察，缓慢转动粗调节器，使油镜头浸没在油滴内，当油镜头几乎接触玻片时停止转动，用肉眼观察接目镜，缓慢调节粗调节器，使镜筒上升（只能上升，不能下降，以防压碎标本片和损坏油镜），待看到模糊物像时，再调节细调节器，直至清晰看到细菌等微生物形态。

显微镜的使用及保护方法（1）显微镜是精密的光学仪器，使用时应注意爱护，各部分结构不得随意拆卸，以免损坏。

（2）取送搬移显微镜时，要一手持镜臂，一手托镜座，平端在胸前，轻拿轻放。

（3）镜头必须保持清洁，油镜使用后应立即用擦镜纸拭去镜油。若油镜头上的油迹未擦干净，应先将二甲苯滴在擦镜纸上擦拭镜头，再用干净擦镜纸擦去镜头上残留的二甲苯。

（4）显微镜擦净后，接物镜转成“八”字形并降低，下降聚光器，送至显微镜室，对号入座。显微镜的使用及保护方法细菌形态观察基本形态

球菌

葡萄球菌（G+球形、堆积状排列）链球菌（G+球菌、链状排列）细菌形态观察基本形态

球菌

肺炎双球菌（G+球菌）脑膜炎奈瑟菌（G-球菌）细菌形态观察基本形态

杆菌、弧菌

大肠埃希菌（G-杆菌）

水弧菌（G-弧菌）

细菌形态观察特殊结构

芽孢

破伤风梭菌（芽孢位于顶端）

细菌形态观察

特殊结构

鞭毛

伤寒杆菌（周鞭毛）

细菌形态观察特殊结构

荚膜

产气荚膜梭菌（负染法）

革兰染色原理革兰染色的原理目前存在三种假说：1．通透性学说

革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2．等电点学说

革兰阳性菌等电点（pI2-3）比革兰阴性菌（pI

4-5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。3．化学学说

革兰阳性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。草酸铵结晶紫初染1min95%乙醇脱色0.5min碘液媒染1min稀释石炭酸复红复染0.5min涂片干燥固定镜检制片脱色媒染初染复染

革兰染色操作镜检1、鉴别细菌；2、诊断疾病；3、选择用药。革兰染色结果：G+菌为紫色；G-菌为红色。革兰染色临床意义：

革兰染色结果、临床意义1．操作因素涂片太厚或太薄，固定时菌体过分受热，以及脱色时间长短，都会影响染色结果。2．染色因素所有染液应防止染液蒸发而改变浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用；涂片积水过多会改变染液浓度，影响染色效果，如脱色用的乙醇以95%为宜，浓度降低会增强其脱色能力。3．细菌因素细菌的菌龄不同，革兰染色结果也有差异，一般以18-24h的培养物染色效果最好，菌龄过长影响细菌染色性。

革兰染色结果影响因素准确称量－混合溶解－矫正pH值－分装－灭菌－检定－保存培养基的制备过程常用培养基·半固体培养基含0.5%凝固剂（琼脂）·各类液体培养基不含凝固剂（琼脂）·各类固体培养基含2%-3%凝固剂（琼脂）的培养基液体培养基各类液体培养基接种环液体培养基的接种·接种法：液体培养基

·生长现象：表面生长浑浊生长沉淀生长液体培养基中细菌生长现象接种针半固体培养基·接种法：·生长现象：扩散生长无扩散生长

动力阳性动力阴性半固体培养基穿刺接种法固体培养基·平板接种法：平行划线法液体培养基中细菌生长现象固体培养基·平板接种法：四区分离划线1区2区3区4区菌苔菌落常用培养基

固体培养基·斜面接种法：羽毛状生长1.接种环伸入到斜面底部向上划线2.接种环再伸入到底部“之”字形向上划线细菌的分布检查1.空气中的细菌检查根据空间特点计算采样点布置布置采样皿开盖采样一定时间恒温培养结果计算细菌的分布检查2.水中的细菌检查水样做一定稀释后注入平皿中，恒温培养清点菌落形成单位，计算后，