《小反刍兽疫病毒间接磁微粒 CLIA 抗体检测方法》

ICSXX.XXX

XXX

团体标准

T/CVMAXX-20XX

小反刍兽疫病毒间接磁微粒

CLIA抗体检测方法

Indirectmagneticparticlebasedchemiluminescenceimmunoassayfordetecting

antibodiesagainstpestedespetitsruminantsvirus

（征求意见稿）

在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

20XX-XX-XX发布20XX-XX-XX实施

中国兽医协会发布

T/CVMAXX-20XX

小反刍兽疫病毒间接磁微粒CLIA抗体检测方法

1范围

本文件规定了小反刍兽疫病毒间接磁微粒CLIA抗体检测方法的试剂、仪器设备、耗材、操作步骤、

结果判定。

本文件适用于定量检测羊血清中小反刍兽疫病毒的特异性抗体。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，

仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本

文件。

GB19489实验室生物安全通用要求

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

NY/T541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范

GB/T27982小反刍兽疫ELISA检测方法

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件

CLIA:化学发光免疫分析法（ChemiluminescenceImmunoassay）

ELISA：酶联免疫吸附（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay）

5试剂

5.125×浓缩洗液洗液，按照附录A.1配置。

5.2磁微粒工作液（偶联小反刍兽疫病毒N蛋白的磁微粒悬浮液）。

5.3稀释液，按照附录A.2配置。

5.4酶标抗体（碱性磷酸酶标记兔抗羊IgG）。

5.5小反刍兽疫病毒抗体工作校准品

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包括：工作校准品1、工作校准品2、工作校准品3、工作校准品4、工作校准品5、工作校准品6，

抗体含量分别为0U、12.5U、50U、200U、800U、3200U，按照附录B制备。

5.6小反刍兽疫病毒抗体产品校准品

包括：产品校准品1、产品校准品2，抗体含量分别为50U、800U，按照附录C.1制备。

5.7小反刍兽疫病毒抗体质控品

范围：质控品1≤20U，质控品2抗体含量范围应为160U～200U，按照附录C.2制备。

5.8化学发光底物。

6仪器设备及耗材

本方法应准备仪器设备及耗材如下：

——全自动化学发免疫分析仪：磁微粒和酶促化学发光检测设备，LYC100、LYC200等；

——电子天平：最大称量：Max=220g；最小称量：Min=10mg；显示分度值：d=0.1mg；

——离心机：最高转速：16000rpm；

——可调单道移液器（100μL、1mL）；

——1.5mL尖底离心管；

——反应杯；

——试剂船。

7技术原理

本方法使用磁微粒化学发光免疫分析法，采用间接法原理，将小反刍兽疫病毒N蛋白作为抗原偶联

于3μm羧基磁微粒上，并加入待检血清进行抗原抗体结合；再加入酶标抗体进行反应；最后加入化学

发光底物，读取发光值，待检样本抗体含量和发光值呈正相关。本方法通过检测小反刍兽疫病毒N蛋白

抗体工作校准品建立校准曲线，并通过校准曲线计算待检样本中小反刍兽疫病毒N蛋白的抗体含量，以

判定阴阳性结果。

8检测前准备

8.1样品采集及保存

样品采集按照NY/T541进行。无菌注射器静脉采血，不少于2mL，用自然析出法分离血清后，置

于无菌血清管中，按照GB/19489样品处理的生物安全措施、实验室生物安全通用要求处理样本，若在

一周内检测，可置2℃~8℃条件下保存，若超过一周检测，应置于-20℃以下冷冻保存。

血清样本运输时应注意2-8℃冷藏。

8.2样品处理

取8.1中的样品，8000r/min，离心2min，取上清放于1.5mL尖底离心管中，体积应大于300μL，待

检；若样品中存在沉淀或絮状物等杂质，应离心去除杂质，用移液枪吸出上清液，枪头贴壁移至新1.5mL

尖底离心管中，轻微操作，避免出现泡沫。

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8.3溶液配制

洗涤液：将25×浓缩洗液用无离子水或蒸馏水1:25倍稀释，装入洗涤液桶。

无离子水或蒸馏水均应符合GB/T6682的要求。

8.4仪器准备

阅读全自动化学发光免疫分析仪说明书，放置反应杯，扫码放置底物、系统维护液，开始自检。

8.5试剂准备

将偶联磁微粒工作液、酶标抗体、稀释液分别装入试剂船上对应试剂瓶中，将磁微粒用移液枪吹打

混匀，同时试剂船瓶盖换为胶盖；然后将试剂船装入试剂仓中。

9操作步骤

9.1校准曲线拟合

将小反刍兽疫病毒抗体工作校准品1～工作校准品6分别放入样本架，按照9.4进行检测标定，按9.5

制作校准曲线。工作校准曲线示例见附录D。

9.2校准曲线校准

将小反刍兽疫病毒抗体产品校准品1、产品校准品2放入样本架，按仪器说明书对校准曲线进行校准。

以下情况应校准再进行检测：

a)试剂成分发生改变；

b)同一批次试剂盒使用周期超过28d；

c)质控结果不符合要求。

9.3质控

需要时检测质控血清，检测值在参考范围内，方可继续样本检测。

如下情况应检测质控品：

a)试剂成分发生改变或校准曲线校准后；

b)质控品超过24h需检测1次。

9.4样品检测

取待检样本于1.5mL/2mL离心管中（样本量需300μL以上），置于专用样品架，设置测试样品信息，

进行检测。

整个检测过程在全自动化学发光免疫分析仪上进行，具体检测过程如下：

a)免疫反应：取20μL待测样本，25μL磁微粒工作液、55μL稀释液，分别加入反应杯中，37℃孵育10

min；

b)清洗：使用磁铁吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，弃去上清液。加入1×洗涤液300L悬浮磁微粒，

混匀30s后吸附磁微粒，弃去1×洗涤液。重复清洗4次。

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c)酶反应：取100μL酶标抗体加入反应杯中，37℃孵育10min；

d)清洗：使用磁铁吸附磁微粒30s，使其聚集于管壁，弃去上清液。加入1×洗涤液300L悬浮磁微粒，

混匀30s后吸附磁微粒，弃去1×洗涤液。重复清洗4次。

e)检测：加入化学发光底物溶液100L于清洗后的反应杯中，混匀30s悬浮磁微粒，37℃反应3min，

检测发光值（RLU）。

f)计算：将发光值（RLU）代入校准曲线，计算样本中小反刍兽疫病毒抗体含量。

9.5结果计算

检测完成后，以工作校准品抗体含量（0U、12.5U、50U、200U、800U、3200U）为横坐标、

相应检测发光值为纵坐标，拟合四参数为校准曲线，四参数公式为Y=(a-d)/[1+(x/c)*b]+d，当R2高于0.99

时，可以用于结果计算和判定。将待检样品检测发光值代入校准曲线，计算结果即为待检样本中小反刍

兽疫病毒抗体含量。

10结果判定

10.1质控血清参考范围

质控品1抗体含量≤20U，质控品2抗体含量范围应为160U～200U，实验结果成立。

10.2阴阳性判定依据

抗体含量≥90U时，判为小反刍兽疫病毒抗体阳性；抗体含量＜90U判为小反刍兽疫病毒抗体阴性。

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附录A

(规范性)

试剂的配制

A.125×浓缩洗液配制，见表A1：

表A.125×浓缩洗液配方

名称称量

丁二酸1.98g

六水丁二酸钠62.16g

氯化钠225.00g

吐温-2013.75g

加灭菌蒸馏水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存备用。在使用时用无菌蒸馏水

稀释25倍为1×洗液使用。

A.2稀释液配制，见表A2：

表A.2稀释液配方

名称称量

磷酸氢二钠1.15g

氯化钠8.00g

磷酸二氢钠0.20g

吐温-200.50mL

加灭菌蒸馏水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存备用。

A.3校准品稀释液配制

表A.3校准品稀释液配方

名称称量

磷酸氢二钠1.15g

氯化钠8.00g

磷酸二氢钠0.20g

牛血清白蛋白1.00g

海藻糖5.00g

吐温-200.50mL

加灭菌蒸馏水至600mL，溶解，定容至1000mL，置于2℃~8℃保存备用。

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附录B

(规范性)

小反刍兽疫病毒抗体工作校准品制备

B.1小反刍兽疫病毒高免血清制备

使用小反刍兽疫弱毒活疫苗（传代细胞苗）免疫60日龄SPF羊，按2头份剂量，颈部肌肉注射接种。

可进行3～4次免疫，在初次免疫后21天进行加强免疫，14天后检测抗体水平，如达不到要求，再进行第

三、第四次免疫。

抗体水平达到要求后，采集颈部静脉血，用自然析出法，3000r/min离心10min，分离血清，然后用

0.22μm滤器过滤除菌，加入proclin300，使终浓度为0.05%（V/V），分装，-20℃保存备用。操作满足

生物安全实验要求《中华人民共和国生物安全法》《病原微生物实验室生物安全管理条例》。

抗体水平合格标准：对采集的血清样品，使用小反刍兽疫竞争ELISA检测方法（GB/T27982）检测

抗体水平，以检测样本为阳性的最大稀释滴度判断小反刍兽疫病毒抗体水平。若抗体水平大于1∶4096，

则为合格的原始高免血清。制备好的小反刍兽疫高浓度抗体标准血清分装于无菌血清管中，-20℃条件

下保存备用，操作满足生物安全实验要求（GB/19489）。

B.2小反刍兽疫病毒抗体工作校准品制备

用工作校准品稀释液梯度稀释B.1所制备的高免血清，小反刍兽疫ELISA检测方法（GB/T27982）

检测，并计算检测结果，定义ELISA检测阳性的最大稀释滴度的稀释血清抗体含量为100U，若此份

血清为1∶32稀释，则1∶64稀释血清为50U，依次类推。工作校准品稀释液定义为0U，最终选择0

U、12.5U、50U、200U、800U、3200U分别为工作校准品1、工作校准品2、工作校准品3、工作校

准品4、工作校准品5、工作校准品6，稀释的工作校准品-20℃保存备用，36个月内有效。

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附录C

(规范性)

小反刍兽疫病毒抗体产品校准品、质控品

C.1小反刍兽疫病毒抗体产品校准品制备

取B.1所制备的小反刍兽疫病毒高免血清，用校准品稀释液稀释至抗体含量为50U、800U，分别

为小反刍兽疫病毒抗体产品校准品1、产品校准品2。

C.2小反刍兽疫病毒抗体质控品制备

取B.1所制备的小反刍兽疫病毒高免血清，用工作校准品稀释液稀释至抗体含量为12.5U、200U，

分别为小反刍兽疫病毒抗体质控品1、质控品2，使用小反刍兽疫病毒抗体间接磁微粒CLIA检测方法

检测5次，计算平均值，质控范围为Mean±3SD。

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附录D

(资料性)