细胞培养技术

春来花开艳，蜜蜂采蜜忙！1/18/20251请欣赏1/18/20252三、体外细胞生长的基本条件(一)细胞接种量(二）维持、促进细胞生长、繁殖的物质

1.无机离子：Na+、K+、Ca2+、Cl-、PO43-、SO42-2.氨基酸：

3.碳水化合物：常用葡萄糖

4.维生素：维持细胞生长的生物活性物质

5.蛋白质：必不可少的成分，动物血清是蛋白质的来源1/18/20253三、体外细胞生长的基本条件(三）酸碱度：最适pH为7.0~7.4，细胞能承受的范围是6.6~7.8。细胞抗酸能力比抗碱能力好。

(四）气体条件：O2和CO2(五)温度：一般最适温度为33℃~37℃，对高温的抵抗力弱于对低温的抵抗力。1/18/20254三、体外细胞生长的基本条件(六）水：双蒸水，玻璃蒸馏器重蒸，最好现制现用。

(七）无菌条件在培养液中加入青、链霉素防止细菌污染；制霉菌素或两性霉素防霉菌污染；卡那霉素防支原体污染。1/18/20255第二节细胞培养技术1/18/20256细胞培养操作人环境生长条件1/18/20257细胞培养技术要解决的问题：仪器设备如何培养细胞如何培养病毒如何检查病毒1/18/20258一、细胞培养的基本设施与条件

（一）实验室：

1.清洁区：所有无菌操作均应在此区域完成。超净工作台离墙放置以利清洁。无菌器械应置于该区域相邻的位置，便于取用。操作台等表面应耐日常消毒和紫外线照射

2.工作区：应有适当的通风和温度控制。尽量减少走动以避免空气混流及灰尘污染。表面应耐水，并易于消毒。同时应有防尘的抽屉、橱柜，用于储存实验用品。

3.洗涤区：安排在实验室的入口处。存放标本的冰箱，压力蒸汽灭菌器及其它设备。并应设有工作人员更换衣服鞋帽的位置。

1/18/20259一、细胞培养的基本设施与条件

细胞培养必需避免细菌和真菌污染，因此，细胞培养区域最好处于滤过空气的正压状态，且该区域内的设备及家具应尽量少放置，以利清扫及减少积尘。细胞培养实验室设计的原则是保证无微生物污染和不受其他有毒、有害因素的影响。1/18/202510一、细胞培养的基本设施与条件与细胞培养相反，病毒工作区域最好处于负压状态，空气经过滤后排出室外。理想的病毒实验室应有多个房间并有单独的通气和排污系统。

1/18/202511

（二）设备

1.超净工作台或生物安全柜

2.显微镜：倒置显微镜

3.水浴箱

4.离心机

5.培养箱：CO2培养箱、普通培养箱

6.冰箱、冷柜与液氮罐

7.压力蒸汽灭菌器和干烤箱1/18/202512二、实验室常用洗涤、消毒和处理方法（一）无菌间的消毒处理：可采用紫外线照射、福尔马林熏蒸等方法进行消毒处理。（二）实验室桌面及地面的消毒处理：可采用一定浓度的新洁尔灭、过氧乙酸、含氯消毒剂进行消毒处理。1/18/202513

1、玻璃器材的选择：

2、玻璃器材的处理

1）新玻璃器材的处理：

2）使用后之玻璃器材的处理：

3、玻璃器材的清洁：

4、玻璃器材的灭菌：

湿热、干热（三）玻璃器材的洗涤、消毒处理中性硬质、耐酸、耐高温、透明度好、壁光滑去尘、中和碱去除污染清洁液浸泡、冲洗、浸泡湿热、干热1/18/202514清洁液的配制配制与使用时应注意何问题？1/18/2025151/18/202516

培养瓶1/18/202517培养板1/18/202518（四）滤器的清洁消毒

在细胞培养中，滤器是常常要用到的器材之一，主要用于不能或不宜采用高压灭菌手段进行消毒的试剂或液体的除菌。实验室常用的除菌滤器有玻璃滤器和蔡氏滤器两种。1/18/2025191、玻璃滤器：新购置玻璃滤器的处理:

除尘滤器孔径是否一致除菌效果合格后方可使用。消毒处理:用过滤的方法进行消毒处理。即自来水冲洗干净，晾干后将玻璃滤器斗内装满硫酸一重酪酸钾清洁液，下接滤瓶，让清洁液自然滴落，待斗内清洁液全部滴落完毕时，再用蒸馏水抽洗到滤过的蒸馏水pH为中性时止。晾干后与过滤瓶分别包装，15磅蒸汽15分钟灭菌。1/18/202520

用于感染性或可疑感染性材料后的玻璃滤器，在使用后须经1％次氯酸钠浸渍过夜后，再按上述方法清洁、灭菌。2、蔡氏滤器：蔡氏滤器是用金属器将石棉板夹在中间，作为除菌过滤之用。每次使用后，弃去用过的石棉板，洗净金属器，晾干。使用前，夹入新石棉板(光面向下)，将金属筒扭紧，包装后与过滤瓶分别经15磅蒸汽15分钟灭菌即可。1/18/202521滤器1/18/2025221/18/202523（五）橡皮塞和橡皮管的清洁消毒

要求质软、弹性力强、能耐高压、对细胞无毒性。新橡皮管（塞）处理：2%氢氧化钠溶液中煮沸15分钟，自来水洗涤；再用4%盐酸溶液煮沸15分钟，自来水洗涤多次，再用蒸馏水冲洗5次以上。橡皮塞于使用前，用蒸馏水煮沸10分钟灭菌，趁热将煮盒内蒸馏水倒净，置已断电源尚有余热的电炉上烘烤2-3分钟，使其干燥。橡皮管可根据试验要求采用煮沸或蒸汽灭菌。1/18/202524

三、细胞培养的主要试剂在体内，循环的体液能持续地提供细胞和组织营养物质并排出代谢废物。这些体液能够提供细胞在体内存活、分化和生长的所有成分。在体外生长的细胞也完全依赖于培养液而获得营养需要。培养用液是与细胞直接接触的液体，是细胞的外环境。因此，要求在配制过程中严格谨慎，以保证质量，使细胞培养顺利进行。1/18/202525三、细胞培养的主要试剂

（一）培养用液和试剂

1.平衡盐溶液(BalancedsaltsolutionBSS)Hank’s液、Earle液、PBS主要成分：无机离子、葡萄糖、指示剂制备时的注意点见P21Hank’s液、D-Hank’s液作用？用途？1/18/202526三、细胞培养的主要试剂2.培养液：分为二类

生长液：用于促进培养物的生长，一般含有血清和其它促进细胞迅速繁殖的物质。维持液：使培养物的代谢维持在稳定的状态，溶液中促进细胞代谢和繁殖的物质较生长液少。

1/18/202527三、细胞培养的主要试剂生长液：天然生长液：合成生长液：常用的有Eagle：常用的是低限量Eagle培养液（minimumEaglemedium，MEM）及改良Eagle基本培养基（basalmediumEagle，BME）、Dulbecco改良的Eagle培养基（Dulbecco‘smodifiedEaglemedium，DMEM）RPMI1640（RooseveltParkInstitutemedium1640）种类：水解乳蛋白、小牛血清优点：含有丰富的营养物质及各种细胞生长因子、激素类物质，渗透压、pH等也与体内环境相似。缺点：成分不明确的混合物、可能会引入污染、个体差异导致结果的不一致。是否需要选择培养基1/18/202528三、细胞培养的主要试剂3.细胞分散剂：用于分离组织和细胞

1）胰蛋白酶液：胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。浓度0.25%或0.125%；温度37℃或室温；pH7.8，D-Hanks液配制。酶的活性可被血清灭活。

2）EDTA液：主要作用是与维持组织完整的Ca2+、Mg2+离子结合，使细胞分散。使用浓度0.02%。

3）胰酶-EDTA消化液：0.25%-0.02%1/18/202529三、细胞培养的主要试剂4.酸碱调节剂：

在大多数培养基中，Na+、K+、HCO3-和HPO42-是主要的pH调节成分。磷酸盐缓冲液和碳酸／碳酸氢盐缓冲系统与血液中的缓冲系统相似，常用于细胞培养中的pH调控。尽管在生理pH时，碳酸氢盐的缓冲能力较低，但因费用低廉且无毒性，故仍然是最常用的。HEPES：在生理pH的整个范围内，具有更强的缓冲能力。在有血清的培养液内，10～25mmol/LHEPES对大多数细胞无毒性。

7.5%NaHCO31/18/202530三、细胞培养的主要试剂

5.酸碱指示剂:用于指示溶液酸碱度的变化情况。以便用肉眼观察pH的改变。

0.4%酚红溶液

对细胞基本无毒

pH6.8时，酚红呈现黄色，pH7.0时为桔红色，pH7.4时为红色，pH7.8以上时则为紫红色。颜色十分容易观察。对细胞的毒性变色范围颜色的变化1/18/202531三、细胞培养的主要试剂6.抗生素

青霉素G的使用浓度为100～250U／ml，抑制大多数G+菌，但青霉素G不稳定，35～37℃48h后,即被降解灭活。硫酸链霉素较青霉素稳定，35～37℃可维持4d,抑制许多G-菌。常联合应用青霉素(100～250U／ml)和链霉素(100ug／ml)。

庆大霉素对多种G+和G-均有效，并且能抑制常污染细胞培养的多种支原体，常用浓度为5～10ug／ml，35～37℃能维持2周。1/18/202532三、细胞培养的主要试剂二性霉素B等抗真菌抗生素，可根据需要选用，浓度：l~4ug／ml，35~37℃时半衰期为4d，抑制真菌生长而非杀死真菌。长期使用可致低水平的、常常是隐性的真菌污染。当细胞适应了这种低水平污染所致的培养条件改变时，其表型常可出现改变。因此，二性霉素B不宜常规应用于细胞传代。如确需使用，则应定时撤除。病毒分离时不涉及细胞传代，可以常规使用二性霉素B。1/18/202533

四、各种细胞培养方法1/18/202534

胰蛋白酶EDTA

单个细胞

完好细胞膜损伤 死亡细胞核完好

良好的生长条件 贴瓶

繁殖 单层细胞培养过程新鲜的组织小块1/18/202535细胞培养的基本程序组织的获得与处理：无菌取组织，洗涤，剪碎，洗涤分散组织：方法（机械法、消化法），洗涤获得单个细胞悬液：吹打分散（维持液?）细胞计数与分装：活力检查，一定浓度，分装培养与观察1/18/2025361/18/202537观察的内容：

是否被污染；细胞生长状况；生长液的pH。观察时的注意事项：

1）初培养：48h内，不应镜检或摇动，以免影响细胞贴壁。2）镜检或换液时，培养瓶不宜在室温放置过久，要随用随取，速放回。3）培养瓶镜检完毕，注意细胞面朝下放平，使培养液浸渍整个细胞面。切勿倒置。

1/18/2025381/18/2025391/18/202540四、各种细胞培养方法

1、原代细胞培养

2、传代细胞培养（二倍体细胞株、传代细胞系）

3、同管两种细胞培养

4、旋转管培养法

5、微量细胞培养

P24-271/18/202541传代细胞培养的过程图示致密单层细胞在细胞瓶上呈雾状，使瓶壁呈半透明：弃去培养液，在此可先摇动细胞瓶，使老化死亡贴壁情况不好的细胞随培养液弃去。1/18/202542细胞完全皱缩变圆，此时应弃去胰酶，加入培养基后轻摇可将细胞从细胞瓶壁上洗下，将细胞悬液用吸管吹散后传代：有经验后，可肉眼对光观察帖壁半透明的细胞层，判断消化程度。

细胞基本皱缩变圆，此时细胞吹打可下。

细胞开始皱缩但不明显，仍维持细胞正常形态刚加入胰酶，细胞仍呈致密单层

细胞明显皱缩变小，细胞间隙增大不再致密，部分细胞维持正常形态，部分细胞皱缩变圆

如消化过头，会见到许多细胞脱落随弃去的胰酶溶液流失。也可以在倒数第二、三步时弃去胰酶，用瓶中残留的胰酶继续作用至最后一步的消化程度，这样略有点过也影响不大。

1/18/202543四、各种细胞培养方法6、微载体培养(Micro—carrierculture)传统的贴壁依赖性细胞的培养通过静止或转瓶等培养来获得，操作繁复，且耗费空间及人力。1967年，VanWezel首次提出了“微载体”培养系统，使贴壁依赖型细胞贴附在微载体上悬浮于液体培养基中生长，兼具平板培养和悬浮培养的优势，增加培养面积同时获得均一的环境培养条件(温度、pH值、CO2

浓度、葡萄糖浓度等)，便于控制放大获得高密度培养细胞和优化下游控制。1/18/202544四、各种细胞培养方法7、中空纤维培养(Hollowfibresculture)1972年，RichardKnazek首次报道此技术。该技术是模拟细胞在体内生长的三维状态，利用一种人工的“毛细管”即中空纤维给培养的细胞提供物质代谢条件而建立的一种体外培养系统．中空纤维表面具有海绵状多孔结构，既能使水分子、营养物质和气体透过，也能使细胞在上面贴附生长。该技术的特点是：细胞培养环境温和，培养细胞密度较高，产品较容易分离纯化。1/18/202545四、各种细胞培养方法8、微囊法培养(Micro—encapsulationculture)微囊化培养技术是20世纪70年代由Lin和Sun创建的一种大规模培养技术，其要点是：在无菌条件下将拟培养的细胞、生物活性物质及生长介质共同包裹在薄的半透膜中形成微囊，再将微囊放入培养系统内进行培养。培养液中的水和营养物质可透过半透膜进入微囊供应给细胞，细胞的代谢物也可透过半透膜被排出，而细胞分泌的大分子物质则被阻留而积累在囊内。微囊化培养的优点：a.细胞能生长和维持在小体积的培养液中，这使培养液中的分泌产物变浓，简化了下游加工；b.培养液易于迅速改变，且无分离细胞与培养液的困难；c.微囊固定化细胞还能使细胞较少暴露于物理损伤环境中。用微胶囊培养可保护细胞在胶囊内，可起到中空纤维的某些作用，也可避免反应器的剪切力对细胞的损伤。1/18/202546细胞培养中应注意的一些问题

1、消化时间问题：“透”！

2、细胞的保存问题：取到早代细胞种子时一定要及时地保存起来以防丢失或污染。

3、温度的问题：温度增加2-3℃对细胞产生不良影响，使之在24小时之内死亡。低温对细胞影响较小。细胞一般37℃放7天大部分脱落。室温放10天不但脱落，形态都有一些代谢改变。在4℃放20天细胞能保持良好形态，如需使用时在37℃放置2—3小时即可。

4、血清问题：种类、质量、浓度细胞相互已分离，间隙加大，胞体趋于变圆。1/18/202547五、细胞培养物的保存、复苏及运输1．保存①盛玻璃球的试管培养法：②降温维持法：

③冻结保存法：冷冻保护剂：甘油、二甲基亚砜（DMSO）低温要求：-70℃或液氮（-150℃至-196℃）

原则：慢冻？1/18/202548慢冻程序标准程序：

当温度在-25℃以上时，1～2℃/min；当温度达-25℃以下时，5～10℃/min；当温度达-100℃时，可迅速放入液氮中。简易程序：

将冷冻管（管口要朝上）放入纱布袋内，纱布袋系以线绳，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降1～2℃的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投人液氮中。1/18/202549五、细胞培养物的保存、运输及复苏2．冻存细胞的复苏：原则快融3．运输：

悬液状态（每ml生长液含100万个细胞），单层培养运输时，生长液装满培养瓶，冰盒运输。##1/18/202550细胞复苏的方法

（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37～38℃水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养后进行培养。***1/18/202551细胞悬液可用下述方法使之稳定，以备运输。①用生长液稀释胰酶消化细胞，每毫升不要超过60万个细胞，然后在0～4℃放24小时。②取出后，细胞悬液以200rpm沉淀30分钟，弃去含细胞毒素的上清液，再加入生长液，使最终浓度为