化学品 快速雄激素干扰活性报告试验 征求意见稿

2GB/TXXXXX—XXXX化学品快速雄激素干扰活性报告试验本文件规定了化学品快速雄激素干扰活性报告试验的术语、定义和缩略语、试验原理、受试物信息、参比物、仪器设备、方法概述、试验准备、试验过程、试验的有效性、数据与报告。本文件适用于试验和评价受试物的雄激素干扰活性；用于测定受试物在含有spg1-gfp转基因品系日本青鳉（Oryziaslatipes）胚胎中的荧光强度。本文件适用于不挥发或低挥发性、水溶性或非水溶性、能被精确测定的所有受试物。本文件不适用于易挥发的受试物。若用于试验混合物，UVCB（不明复杂物质）或多组分物质的试验，应尽可能地对其成分进行表征，例如，其成分的化学特性、定量情况和物质特性。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。HJ1257-2022化学物质环境管理化学物质测试术语GB/T27850-2011化学品快速生物降解性通则GB/T21803-2008化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T21856-2008化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21802-2008化学品快速生物降解性改进的MITI试验(Ⅰ)GB/T21831-2008化学品快速生物降解性密闭瓶法试验GB/T21802-2008化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验GB/T21801-2008化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T27861-2011化学品鱼类急性毒性试验OECDNo.23困难物质和混合物的水生毒性试验指南（GuidanceDocumentonAquaticToxicityTestingofDifficultSubstancesandMixtures）OECDNo.54生态毒性试验数据的统计分析方法指导（CurrentApproachesintheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuidancetoApplication）3术语、定义和缩略语3.1术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1.13GB/TXXXXX—XXXX效应浓度XtheconcentrationgivinganeffectattheX%ofmaximumlevel(ECx）引起一组受试生物中的X%生物出现某观察效应的浓度。3.1.2游离胚胎eleutheroembryo胚胎孵化后的生命阶段，但在胚胎能够独立进食外源性食物供应之前，是胚胎发育的阶段。在本试验中定义为日本青鳉胚胎从第39期发育阶段（孵化阶段）到第42期发育阶段（形成捕获猎物所需的结构，包括上颌的牙齿、耳石和所有鳍的形状）的发育阶段。3.1.3最低可观察效应浓度thelowestobservedeffectconcentration(LOEC)在给定试验周期内，与对照组相比，在统计学意义上对受试生物产生显著效应（p<0.05）的最低受试物浓度。3.1.4最大耐受浓度maximumtoleranceconcentration(MTC)受试物引起小于10%死亡率的最高受试物浓度。3.1.5无可观察效应浓度noobservedeffectconcentration(NOEC)在给定试验周期内，与对照组相比，在统计学意义上对受试生物未产生显著效应（p<0.05）的最高受试物浓度。3.1.6加标模式spikedmode在额外添加AR激动剂（即浓度为3µg/L的17α-甲基-5α-二氢睾酮）的情况下进行的快速雄激素干扰活性报告试验。3.1.7未加标模式unspikedmode未额外添加AR激动剂（即浓度为3µg/L的17α-甲基-5α-二氢睾酮）的情况下进行的快速雄激素干扰活性报告试验。3.2缩略语下列缩略语适用于本文件。RADARassay：快速雄激素干扰活性报告试验（RapidAndrogenDisruptionActivityReporterassay）GFP：绿色荧光蛋白（Greenfluorescentprotein）17MT：17α-甲基睾酮（17α-Methyltestosterone）11KT：11-酮睾酮（11-Ketotestosterone）mDHT：17α-甲基-5α-二氢睾酮（17α-Methyl-5α-dihydrotestosterone）4GB/TXXXXX—XXXXMS222:：甲磺酸三碱（Tricainemethanesulfonate）DMSO：二甲基亚砜（Dimethylsulfoxide）dpf：受精后的天数（Daypostfertilisation）dph：孵化后的天数（Dayposthatch）AR：雄激素受体（Androgenreceptors）ER：雌激素受体（Estrogenreceptors）UVCB：不明复杂物质（Substancesofunknownorvariablecomposition,complexreactionproductsorbiologicalmaterials）OECD：经济合作与发展组织（OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment）GD：经济合作与发展组织指导文件（OECDguidancedocument）4试验原理本试验方法利用携带spg1-gfp遗传构建题的转基因品系日本青鳉（Oryziaslatipes）胚胎，检测具有潜在雄激素干扰活性的受试物。spg1-gfp遗传构建体包含与绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因偶联的spiggin1基因的启动子。在将受试生物暴露于受试物后，spg1基因的转录可能被激活或抑制，GFP报告基因随之以不同程度发出荧光，因此可以通过对其荧光强度的测定判断受试物是否具有雄激素活性。本试验是在半静态暴露体系下，将含有spg1-gfp遗传构建体的转基因品系日本青鳉（O.latipes）胚胎在有或没有激动剂（3µg/L17MT）联合暴露的情况下（即“加标模式”和“未加标模式”），暴露于一定浓度范围的受试物溶液中。至少设置5个不同浓度的受试物处理组，以及相应空白（培养基和/或溶剂）对照组、激动剂对照组、激动剂+拮抗剂对照组等。本试验通过采集转基因spg1-gfp青鳉胚胎的GFP荧光图像，并对荧光信号的定量统计，以对具有雄激素活性的受试物的正确分类。5受试物信息受试物的信息应包括：a)单组分物质：物理外观、水溶性和其他相关物理化学性质；化学标识号，如IUPAC或CAS名称、CAS编号、SMILES或InChI代码、结构式、纯度、杂质的化学标识（视情况而定）和实际可行性等（如适用，包括有机碳含量）。此外，还可包括光稳定性、试验条件下的稳定性、pKa、Kow、归趋信息及其在试验系统中快速降解性等信息，例如，生物降解性试验的结果，参见GB/T27850-2011《化学品快速生物降解性通则》；b)多组分物质、UVCB和混合物：尽可能表征其化学特性（见上文）、定量组分及其成分的相关物理化学性质；c)受试物的定量分析方法，包括定量限值；d)关于受试物稳定性或溶解性的初步研究的现有数据或结果；e)在发射波长450-500nm(λEM=500–550nm）无荧光的结果；以及在这些波长下显示有荧光但在胚胎内没有荧光的结果。必要时，应了解受试物在试验介质中的溶解性，并采用有已知准确性、精度和灵敏性的有效分析方法定量暴露溶液中的受试物，并报告分析效率和定量限。5GB/TXXXXX—XXXX6参比物在使用本文件之前，应采用表1中列出的四种参比物以验证方法的有效性。表1mDHT、利谷隆、头孢呋辛和色苷酸钠参比物信息表7仪器设备所需仪器设备如下：a)培养箱（或适当的温度与光照控制设备）；b)化学惰性材料制成的透明细胞培养6孔板；c)如果从下往上观察，用底部透明的黑色96孔板荧光成像和定量；如果从上往上观察，使用黑色塑料表面荧光成像和定量；d)pH计；e)配备光源的体式显微镜（用于观测受精卵/未受精卵）；f)配备GFP长通滤光片和彩色照相机的荧光显微镜，用于荧光成像和定量（OECD，2022）；g)图像分析软件；h)适用于受试物的分析设备或外包分析服务。8方法概述8.1试验设计利用spg1-gfp遗传构建体的转基因青鳉胚胎（发育至0dph时期）在有或无3µg/L17MT联合暴露的情况下（即“加标模式”和“未加标模式”），在六孔板中暴露于受试物，三个重复，周期为72h。每次试验至少设置5个不同浓度的受试物处理组，以及相应空白（培养基和/或溶剂）对照组、激动剂对照组、激动剂+拮抗剂对照组等。在半静态暴露体系下，每个试验组（包括处理组和对照组）包括四个孔，每个孔使用5个胚胎，共20个胚胎，每天更换暴露溶液（即24h和48h后）。若受试物为不挥发性物质，处理组或对照组可共用同一个孔板。五个处理组和对照对照组设置三个重复试验，每个重复试验需要使用280个胚胎，三个重复共需要840个胚胎。该试验通过荧光成像技术测定转基因spg1-gfp胚胎的GFP荧光，并完成荧光信号的定量统计。试验条件概述见附录A。8.2试验对照6GB/TXXXXX—XXXX本试验所有对照组的有机溶剂浓度应相同（如适用但应尽可能不使用有机溶剂或控制最大溶剂浓度为100mg/L（0.01%），选用溶剂二甲基亚砜（DMSO）时浓度不超过0.2%。。a)空白（培养基和/或溶剂）对照组：4个孔，每孔5个胚胎暴露于空白中。该对照组用于确定空白中的荧光强度基线。如果使用其他溶剂，则将该组暴露溶液从空白换成与其它各组浓度相同的溶剂介质中。在某些情况下，如使用的溶剂没有可用的历史数据，则可能需要同时设置空白对照组和溶剂对照组；b)3µg/L17MT激动剂对照组：4个孔，每孔5个胚胎，暴露于3µg/L的17MT，用于确定17MT浓度为3µg/L时的荧光强度。如果需要设置下述的附加对照，则该组的结果可用于附加对照中17MT标准曲线的计算，并可从标准曲线上读出任何具有促雄激素效应的受试物的17MT当量值（选做）；c)10µg/L17MT激动剂对照组：4个孔，每孔5个胚胎，暴露于10µg/L的17MT，用于确定17MT浓度为10µg/L的荧光强度。如果需要设置下述的附加对照，则该组的结果可用于附加对照中17MT标准曲线的计算，并可从标准曲线上读出任何具有促雄激素效应的受试物的17MT当量值（选做）；d)3µg/L17MT激动剂+500µg/L氟酰胺拮抗剂对照组：4个孔，每孔5个胚胎，暴露于3µg/L的17MT和500µg/L的氟酰胺，用于与单独使用17MT3µg/L的对照组对比，以确定500µg/L浓度氟酰胺的荧光抑制作用。如果需要设置下述的附加对照，则该组的结果可用于附加对照中氟酰胺标准曲线的计算，并可从标准曲线上读出作为AR拮抗剂的受试物的氟酰胺当量值，用于任何在加标模式（存在3µg/L的17MT）下表现出抗雄激素活性的受试物。由于本试验结果只能证明受试物是否具有雄激素效应相关的活性，因此计算上述的当量值不是必须的，该数据仅供参考。如果确定要计算相关当量值，则每次需设置以下附加对照组。以下的附加对照组是选做的，建议用于实验室参数校准以及质量控制。时的荧光强度。该对照组可与3µg/L17MT组和10µg/L17MT组共同用于计算17MT标准曲线。可通过标准曲线，计算用于诱导雄性激素轴信号的受试物的17MT当量值；b)3µg/L17MT+167µg/L氟酰胺：4个孔，每孔5个胚胎，暴露于3µg/L17MT和167µg/L的氟酰胺。该对照组用于与单独使用17MT3µg/L的对照组相比，确定167µg/L浓度氟酰胺的荧光抑制作用。该对照组可用于计算氟酰胺的标准曲线；c)3µg/L17MT+55.6µg/L氟酰胺：4个孔，每孔5个胚胎，暴露在3µg/L17MT和55.6µg/L的氟酰胺。该对照组用于与单独使用17MT3µg/L的对照组相比，确定55.6µg/L浓度氟酰胺的荧光抑制作用。该对照组可用于计算氟酰胺的标准曲线；d)3µg/L17MT+18.5µg/L氟酰胺：4个孔，每孔5个胚胎，暴露在3µg/L17MT和18.5µg/L的氟酰胺。该对照组用于与单独使用17MT3µg/L的对照组相比，确定18.5µg/L浓度氟酰胺的荧光抑制作用。该对照组可用于计算氟酰胺的标准曲线。如果试验中使用有机溶剂，所有的对照组和试验组都应保证含有相同浓度的溶剂。此外，对照组的试验结果需通过用于读数的成像系统的有效性标准，如未通过，则试验结果无效。8.3试验平行7GB/TXXXXX—XXXX整个试验包括三个独立重复试验，每次试验按照5个胚胎/孔，4孔/组的分配运行（如图1）。在添加或不添加17MT的情况下，受试物至少设置五个浓度处理组。每次试验必须使用相同的浓度，每次平行使用独立的溶液。应使用在不同批次孵化的胚胎依次进行试验。通过整合三次平行试验结果得到受试物的原始试验数据，每个处理组共包括60个胚胎（n=60），因此可获得60个荧光强度的量化数据。在三次试验均显示阳性反应的情况下不单独展示单个平行下的试验结果，以更准确地估计每个试验组的平均荧光值。图1试验概述9试验准备本试验的受试生物是纯合的spg1-gfp转基因品系日本青鳉胚胎（由两个纯合的spg1-gfp日本青鳉交配得到）。spg1-gfp转基因品系在多个实验室进行培育（见附录A），当受试物在spg1-gfp构建体胚胎中可发出荧光时，可能还需要使用野生型胚胎来验证受试物是否在该胚胎中发出荧光。本文件的暴露试验从胚胎发育至0dph时期开始（26°C约受精后10d）。虽然要求必须是0dph时期胚胎，但它们的受精后天数（dpf）可以不同。单次重复试验中的差异不应超过一个dpf。随机选择胚胎用于不同的暴露组。理想情况下实验室应自行培育胚胎，或者从其他实验室获取胚胎，试验开始之前尽可能延长胚胎的适应期，已达到试验标准见附录C。日本青鳉的饲养、繁殖和护理在许多资料中都有描述，例如Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols第1卷和第2卷（Kinoshitaetal.,2009;Murataetal.,2019），或美国环境保护署日本青鳉养殖指南。8GB/TXXXXX—XXXX每一代spg1-gfp转基因品系都应该通过运行全套完整的对照（包括附加对照）进行验证，确保符合所有有效性标准，以及获得17MT和氟酰胺对照的预期响应曲线。每年应对随机选择的胚胎的发育阶段进行一次质量控制检查，以确保试验结束时游离胚胎的发育阶段不高于第42期。9.2培养基培养基可以是培养日本青鳉胚胎用水（见附录D如矿泉水、山泉水、井水和木炭过滤的自来水。由于不同地区的水质可能有很大差异，因此应进行水质分析以排查可能干扰测定结果的潜在污染物（包括重金属）和化学物质，尤其是在没有关于水质是否适合饲养日本青鳉的历史数据的情况下。特别需要注意的是铜、氯和氯胺，这些化学物质对日本青鳉胚胎具有毒性。培养基中不应使用螯合剂。水质分析结果应包含在报告中。适用于日本青鳉胚胎孵育的培养基的化学特性如附录D中所列。同时，任何能够支持日本青鳉正常生长和发育并满足试验有效性标准的培养介质都适合作为培养基。9.3喂食该试验使用的日本青鳉胚胎从发育至0dph时期开始试验，到3dph时期（约第40期）结束试验。在试验之前或期间都不能喂食（Iwamatsu，2004）。胚胎的卵黄囊直到发育至第41/42期仍然存在，并作为青鳉胚胎发育的能量来源。9.4检测受试物的潜在荧光本试验不适用于检测在激发波长为450-500nm(λEX=450-500nm发射波长为500-550nm(λEM=500-550nm）的荧光范围内自身发出荧光的受试物，以及可以在胚胎内发出荧光的受试物。具有这两种特性的受试物可能会诱发荧光，并被误解为GFP信号，导致受试物被错误鉴定为对雄激素轴有活性。鉴定受试物是否在这些波长下发出荧光的方法为：在96孔板的10个孔中分别添加200µL的受试物溶液，浓度为本文件处理组的最高浓度，然后在96孔板的另外10个孔中分别添加200µL的空白介质，然后使用与胚胎荧光成像和定量相同的仪器和设置对荧光进行定量。通过统计分析评估空白介质和受试物之间的潜在荧光强度差异。首先，进行D'Agostino-Pearson正态性检验。如果空白介质和受试物的荧光数据均符合正态分布，则进行双尾T-检验，以确定两者的荧光数值是否在统计学上具有显著性差异。如果其中一组或两组数据不符合正态分布，则应进行Mann-Whitney检验。如果确定了一种荧光化学物质，则应在26±1°C的温度下，将20个野生型日本青鳉胚胎暴露于这种荧光化学物质72±2h，同时每天更换受试物溶液。然后对荧光进行定量，并将其与在相同条件下仅暴露于空白介质的20个野生型胚胎的荧光强度进行比较。按照上述统计分析方法，对比空白介质与受试物，如果两者的荧光强度值在统计学上存在显著性差异，则认定该受试物是会发出荧光的，且荧光存在于胚胎内，此时本文件不适用该受试物的检测。如果受试物在未加标和加标模式下均能诱发荧光，则存在其已被代谢为荧光代谢物的可能。在这些情况下，应检查图像以确定荧光是否仅限于肾脏。如果不是，则应执行上述暴露野生型胚胎的步骤，以确定该受试物是否代谢为荧光代谢物。9.5试验浓度的选择9.5.1确定最高试验浓度最大耐受浓度（MTC即在三次单独重复试验中，每次导致的死亡率均不超过10%的受试物最高试验浓度。应使用日本青鳉胚胎进行预试验确定暴露浓度范围，以评估可能的毒性。9GB/TXXXXX—XXXX确定暴露浓度范围的预试验应至少设置三个浓度组。浓度的选择一般按几何级数排列，浓度间隔系数不超过10倍。在选定的试验浓度和对照条件下，只需进行一次试验（20个胚胎/组）。预试验可使用野生型或spg1-gfp转基因胚胎，以5个胚胎/孔的密度，在每孔中添加8mL的暴露溶液，每个试验组和对照组均为4孔。通过整合暴露于相同试验浓度或对照的所有20个胚胎的数据，计算得到死亡（和/或畸形）胚胎的百分比。暴露浓度范围的确定中，设置的最高浓度必须导致10%以上的死亡率（和/或畸形），除非最高试验浓度已达到100mg/L或到达受试物最大溶解度。应根据受试物在试验介质中的溶解度限值、MTC、在胚胎中引起10%以上死亡率和/或畸形的最大浓度或100mg/L的最大浓度（以最低者为准）等参考指标确定受试物的最高试验浓度。9.5.2试验浓度范围本试验要求受试物至少有五个试验浓度并通过有效性标准。建议每个相邻试验浓度之间的浓度间隔（间隔系数）为3-10倍。9.5.3受试溶液通常通过稀释储备液得到所设浓度的试验溶液。将每种试验溶液的pH值调节至6.5至8.0之间。配制储备液时，应根据需要使用机械方法（如搅拌、搅动或超声波）或其他适当方法溶解受试物。对于难以试验的受试物，参考OECD发布的第23号关于难以试验受试物的水相水生毒性试验指导文件（OECD，2019b）。在可能的情况下，尽量不使用溶剂或限制最大溶剂浓度为100mg/L（0.01%）。如果确认所使用的溶剂和溶剂浓度能够满足所有有效性标准，则按照OECD第23号指导文件的描述进行（OECD，2019b）。这些有效性标准包括胚胎存活率和对照组的毒性。如果使用溶剂，所有试验浓度组和对照组中的溶剂浓度应保持一致。选择的溶剂是否合适取决于受试物的物理化学特性和日本青鳉的敏感性，最好在预试验中确定。还应考虑溶剂对生殖轴的潜在效应（Hutchinson等，2006年）。在开展试验的第一天配制对照组溶液，储存在4°C条件下，并在每次更新对照组溶液时使用，或每天重新配制。同一配制的对照溶液或试验溶液不得用于不同批次试验。4°C条件下储存的溶液应在温度达到26±1°C后再暴露于胚胎，以防止温度对暴露试验的影响。根据受试物的稳定性，含有受试物的暴露溶液应在试验的当天配制并储存在4°C下，或在每次更新试验溶液之前重新配制。试验期间，对保存在4°C的更新溶液进行分析测量。10试验过程10.1暴露条件将胚胎暴露于化学惰性塑料的细胞培养六孔板中（通常孔内径为34mm、高度20mm）。每孔加入8mL溶液，放置5个胚胎。在每次平行中，每个试验浓度下有20个胚胎。每个对照组包含20个胚胎。如果塑料孔板不适用于检测特殊受试物，则替换为其他玻璃容器（如小直径皮氏培养皿）。在整个试验过程中，胚胎在26±1°C的恒温箱中孵育72±2h，并保持黑暗。这限制了不同培养箱之间的技术差异，并简化了进行试验的要求。如果使用光照周期，则需要特定的波长和强度来限制差异性。这也是试验光敏受试物的优点。在每次独立重复试验时，都应准备一套新的暴露溶液。GB/TXXXXX—XXXX10.2分析检测由于采用半静态换液方法，因此需记录受试物的浓度稳定性。理想情况下，受试物的稳定性应允许暴露浓度在24h内保持在标称浓度的±20%内。对分析试验的最低要求是科学上合理的最低样本量。OECD第23号指导文件提供了相关指导(OECD，2019b)。更新暴露液的时间最长为24±2h。如果在试验系统中不能维持浓度在±20%以内，可以考虑缩短更新周期。对于浓度不能保持在标称浓度80-120%范围内的受试物，允许使用测量浓度的几何平均值；详见OECD指导文件第23号第5章(OECD，2019b)。10.3试验运行a）第0d：1)在胚胎孵化当天（0dph；受精后约10d；温度为26°C）将其放入暴露液中；2)在挑选胚胎时，观察胚胎并将出现明显畸形或身体损伤（如尾部损伤、水肿、脊柱侧弯）的胚胎排除在试验之外（见附录E）。收集健康和外观正常的胚胎至单独的含有合适体积的培养基容器中。选择的胚胎应大小均匀，将大小差异明显的胚胎去除。若在0dph时期健康和正常的游离胚胎数量低于80%，则认定当批次胚胎不适用于试验。在进行试验之前，应在移除死亡和畸形胚胎时确认是否适用于试验；3)试验开始时，使用移液管将5个胚胎转移至六孔板中。去除培养基，并首次添加受试物溶液。注意每次只处理一个孔板，以避免胚胎缺水。b）第1d和第2d应在24±1h和48±2h内分别更换受试物溶液和对照组溶液。检查每个孔内是否有外观异常（损伤、异常游泳行为等）的胚胎。移除死亡胚胎、明显畸形或损伤的胚胎并实施安乐死，并记录所有观察结果。在每次试验中，如果在一个对照组或一个处理组中出现超过10%的累积死亡率和可观察到的亚致死效应，而未受影响的试验浓度少于五个，则应停止试验并查明导致死亡或异常的原因。c）第3d1)暴露72±2h后，对每个胚胎的荧光强度进行定量。首先用8mL不含受试物的培养基更新试验溶液，并移除死亡胚胎或明显畸形的胚胎，记录所有观察结果。如果在一个对照组或一个处理组中出现超过10%的累积死亡率和可观察到的亚致死效应，而未受影响的试验浓度少于五个，则应停止试验并查明导致死亡或异常的原因。不考虑对数据异常的实验组数据进行分析。如果需要对胚胎进行麻醉后成像，则应在六孔板中每孔加入2mL1g/L的MS222（甲基磺酸三卡因）缓冲液；2)建议在将胚胎进行成像的所有情况前都进行麻醉。只有当它们在自由游动时（如在96孔板的孔中才不需使用麻醉。为了避免过度麻醉，只应麻醉一个系列中可读取的生物体数量。必要时，麻醉开始后（1-5min将胚胎转移到用于成像的支架上（如黑色塑料表面或黑色96孔板）。然后用彩色相机和GFP长通滤光片进行成像。使用校准过程中确定的参数，应拍摄到包括每个生物体肾脏在内的背侧区域图像。d）终止试验在读取荧光强度之后，将每个胚胎持续暴露于1g/L的MS222缓冲液至少20min，对其进行安乐死。GB/TXXXXX—XXXX11试验的有效性11.1荧光定量分析本试验依赖于对每个胚胎发出的荧光强度进行量化。为了确保实现适当、准确的定量，应开展预试验。开展预试验是为了校准荧光成像系统并确保设备可读取合适动态范围的荧光测量值（详细说明见附录B）。如果使用替代的荧光测量系统，则应按照荧光成像系统的详细说明（见附录B）对其进行校准和验证。不过，最好使用配备照相机的荧光显微镜，因为这样方便对图片进行质量控制，以识别定位不佳的胚胎或与雄激素轴激活无关的荧光信号（包括荧光粉或纤维，荧光化学物质在胚胎内发出荧光的情况和异常的荧光模式）。11.2试验的有效性为了保证试验结果的有效性，每次运行都应满足以下标准，否则视为无效：a)空白对照组和10µg/L17MT对照组之间测量到的荧光强度之间应具有统计学差异。10µg/L17MT对照组的平均荧光强度值至少为空白对照组或溶剂对照组（如使用溶剂）的300%；b)在17MT存在和不存在的情况下，每个对照组和至少五个浓度处理组的死亡率和/或畸形率，以及由于胚胎定位不佳导致的无效数据（见附录F）的总和不应超过10%。不符合这些标准的组得到的结果是无效的。为了使试验有效，三组重复试验的整合数据应满足以下标准，否则所有三个重复的结果都被视为无a)10µg/L17MT对照组的平均荧光强度值应至少比3µg/L17MT对照组的高10%。这可确保17MT10µg/L组的平均荧光高于3µg/L组的平均荧光，历史数据表明这对于确保检测的准确性非常重要。通常，两者之间的差异远大于10%；b)3µg/L17MT对照组和3µg/L17MT+500µg/L氟酰胺对照组之间的荧光抑制应具有统计学差c)对于三次重复试验，每次试验应至少具有五个“数据有效组”的试验浓度。“数据有效组”的鉴定标准如下：如果三次重复试验（每次最好为20个胚胎）都通过了有效性标准（死亡率、和/或畸形率以及由于胚胎位置不佳（见附录F）而导致的无效数据的总和不应超过10%则该处理组（最好为60个胚胎）可被视为“数据有效组”；d)如果进行了图像质量控制，则这些有效性标准适用于图像质量控制之后。如果观察到与有效性标准有细微偏差，则应考虑与试验数据可靠性有关的结果，并将这些考虑因素包含在报告中。12数据与报告12.1数据处理在分析之前，应从数据中删除从位置不佳的胚胎图像得到的荧光测量值（见附录F）。每个处理组由于胚胎位置不佳导致的综合死亡率和/或畸形率以及无效数据的总和不应超过10%。使用合适的软件处理胚胎的彩色图像，提取GFP的荧光数值。开源的处理软件可选择ImageJ或者最新版本的FIJI（Schindelin等，2012）。为了排除图像中的自发荧光（非GFP荧光建议将图像的红、绿和蓝颜色层分开。然后从绿色层减去红色层，或将红色层的值加倍并从绿色层中减去，接着可以对得GB/TXXXXX—XXXX到的图像应用强度阈值，以减少内源性色素沉着造成的背景干扰。最后对所得图像中所有像素的荧光总和进行量化。这项技术是一种有效限制测量GFP而非内源性（自发）荧光的方式。因为GFP相关的荧光仅出现在绿色层中，而黄色荧光则同时出现在绿色和红色层中。如果在减去未加倍的红色层后仍有一些内源性荧光，则根据成像系统的不同将红色层加倍也是有用的。根据成像系统和所用荧光过滤片的不同，还可以应用其他技术来减少内源性色素沉着对GFP信号定量的影响。一旦证明图像分析工作流程能够满足特定荧光成像系统的验证标准，则应将其应用于所有后续的试验。对于每个有效试验浓度处理组组和对照组，将来自三个独立试验的数据合并，以获得54-60个荧光数据，最多数为60个，因为每个试验条件或对照的运行由20个胚胎组成，试验由三次重复组成。54个值的下限代表每次试验中10%的死亡率和/或畸形率，因此每次平行试验最低获得18个荧光数据。进行三次独立重复试验可提高试验的稳定性。然而这三次重复可能会产生不同的结果。如果是这种情况，则该测定仍被视为有效。只有在根据整合的数据集发现受试物具有活性、且观察到非单调浓度响应曲线的情况下，三次独立重复试验的结果才可相互比较。如果在试验中使用了溶剂，则应对溶剂的潜在影响进行评估，具体做法是对溶剂对照组和空白对照组的统计比较。如果空白对照和溶剂对照之间没有显著的统计学差异，则应使用混合的试验介质和溶剂对照。如果在三次试验中检测到空白对照组和溶剂对照组之间存在统计学上的显著差异，则证明试验失败。应单独分析每次重复试验，以确定溶剂在三次重复中的结果是否可重现。如果显著性差异的确存在，则证明试验失败，应使用新批次的溶剂或其他溶剂进行新的试验。所选溶剂是否符合所有有效性标准也必须得到验证。如果有历史数据表明所选溶剂在所选浓度下与空白对照相比在统计学上没有显著性差异，则可能不需要设置空白对照组。12.2统计分析应根据OECD第54号文件关于《生态毒性数据统计分析的现行方法：应用指南》（OECD，2006年）使用适当的统计方法。一般而言，与对照相比，使用双尾假设检验法（p<0.05）分析受试物对诱发荧光的影响。推荐的统计学方法（已在实验室间的验证过程中进行了评估）是通过D'Agostino-Pearson正态性检验来确定每个暴露组的数据是否符合正态分布，然后，如果数据符合正态分布，则进行Dunn’s检验，然后进行ANOVA检验；如果数据不符合正态分布，或违反齐次方差假设，则进行Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunn检验（详见附录G）。另外，也可使用嵌套ANOVA分析（也称混合ANOVA分析）来分析这类数据，该方法带有随机效应项，可反映每次平行或每个孔带来的变异性。随后可进行Dunnett检验等事后检验，以确定差异的大小和显著性。12.3决策逻辑本文件制定了决策逻辑流程图，为试验和结果解读提供帮助（如图2所示）。该决策逻辑基于三次有效重复试验的汇总统计分析，如果在加标17MT或未加标17MT模式下，受试物至少有一个试验浓度具有活性，并且观察到单调的浓度-响应关系，则认为该受试物呈阳性结果。a)17MT未加标模式中，活性浓度的定义是：与溶剂对照相比，荧光强度在统计学上显著增加的受试物浓度；b)17MT加标模式中，活性浓度的定义是：与3µg/L17MT对照组相比，荧光强度显著增加或减少的受试物浓度。如果观察到非单调浓度响应，则应通过比较三次重复试验结果来确认结果的可靠性。如果结果不可GB/TXXXXX—XXXX靠，应重复试验，可使用不同的浓度范围，以验证结果（见图2）。如果结果可靠，则认为该受试物对雄激素轴具有活性。如果在第二次重复的验证试验中得到相同的结果，则本文件可能不适用于该受试物，可能需要进行替代试验。由于胚胎发育阶段难以生成可检出的雄激素水平，因此在未加标模式下不会出现荧光下降。如果在未加标模式下观察到荧光强度在统计学上显著降低，这可能表明本文件不适用于该受试物，或者生物体、试验条件存在潜在问题，需要进一步调查。应分析单次重复试验，以确定三次重复中是否存在统计学上的显著荧光下降，然后根据专业判断来决定是否重复：可选择不重复多次，只使用一批新的胚胎进行一次重复试验；或者使用较低的浓度范围进行一次完整的试验；或者进行不同的雄激素轴活性试验。图2用于解释试验结果的决策逻辑图OECDGD150文件为分析结果分类群之间的解释和外推提供了进一步指导（OECD，2018）。如果荧光强度在未加标模式下有统计学上的显著下降，详细描述见12.3。13试验报告试验报告应包括以下信息：GB/TXXXXX—XXXX该部分详细信息见第5章。13.2受试生物a)学名、转基因品系、供应商或来源以及培养条件。b)试验前从批次中去除的死亡和畸形游离胚胎的百分比。13.3试验条件a)试验程序（例如试验的浓度、温度、持续时间、半静态、体积、每毫升的胚胎数量b)培养基特性的详细信息（参考矿泉水或泉水、自来水处理说明，如木炭过滤等）或使用的人工培养基及所做的任何测量；c)储备液的配制方法和更新频率（如使用溶剂，应提供溶剂及其浓度信息d)用于暴露的六孔板和用于荧光成像和定量的所有孔板的品牌和参考信息；e)用于定量的荧光显微镜的参考资料和设置。还应提供用于图像分析的方法。13.4结果讨论a)确定试验浓度范围的结果，可用于确定MTC和/或为选择用于正式试验的试验浓度；b)试验浓度，在可能的情况下，还应报告为确定试验容器中受试物的浓度而进行的所有化学分析结果；如适用，报告以适当的统计平均值（例如算术平均值、时间加权平均值等）表示的测得的暴露浓度；还应报告分析方法的回收效率和定量限；c)报告每次试验中死亡和畸形胚胎的数量，以及它们的所在组别和天数；d)报告荧光定量原始数据（例如单个荧光原始数据）。理想情况下，数据应以tab或csv格式收集，文件中应包含以下元数据：日期、受试物名称、使用浓度、溶剂、设备名称、设备信号收集参数、实验室名称、游离胚胎批号和荧光值；e)数据的统计分析和处理方法，包括所使用的统计检验，以及是否和为何进行数据审查；f)所有有效性标准；g)每个试验组（包括所有对照组和受试物浓度组）的荧光平均值及其SEM（平均值的标准误差以图像的形式表示，并与样本量一起在表格中显示；h)在加标和未加标模式下，与其各自的对照组相比，每个浓度的荧光增加或减少的百分比；i)选做且在适用的情况下，提供溶剂的潜在影响的评估结果：溶剂对照组与空白对照组的统计比较（如果包括在本文件中）或先前研究的结果；j)其他已观察到的生物效应或测量结果：报告观察到或测量到的任何其他生物效应（例如，行为异常、畸形或异常色素沉着k)对任何偏离试验或偏离有效性标准的解释，以及对试验结果的潜在后果的考虑；l)在适用情况下，讨论在加标和/或未加标模式下发现的活性浓度；m)得出结论，表明受试物对雄激素轴上是有活性的还是无活性的。GB/TXXXXX—XXXX附录A（资料性附录）试验条件概述表A.1试验条件概述含spg1-gfp的O.latipes胚胎GB/TXXXXX—XXXX附录B（资料性附录）最佳成像设置条件的确定校准校准的目的是虽然采集试验结果的成像设备不同，但确保所有实验室对参比物17MT和氟他胺获得相似的响应程度和灵敏度。校准的两个步骤：1.确定最佳成像设置条件，使浓度为50µg/L的17MT获得合适的GFP诱导结果。2.将这些设置应用于17MT和氟他胺的三次浓度反应试验，以通过使用增加的17MT和氟他胺浓度以及诱导可检测的GFP反应的最低浓度的17MT或氟他胺来检查诱导的幅度。以下两个步骤描述的示例操作中所有暴露溶液使用0.2%的二甲基亚砜（DMSO）。仅作示例；可使用替代溶剂进行相同的试验操作。如果在进行本文件试验时更换了溶剂，或首次试验时没有使用溶剂，则校准过程不需要重复。B.1选择图像拍摄设置第一步是为校准试验确定正确的图像拍摄设置，确定后的这些设置将用于后续的试验。为了选择图像拍摄的设置，将50个胚胎暴露于50µg/L的17MT中，并按照以下方案调整设置。此步骤只需重复一次。B.1.1配制暴露溶液a)试验组由10个孔组成，每孔5个spg1-gfp转基因日本青鳉鱼的胚胎；b)所有孔中DMSO的最终浓度为0.2%；c)配制50mg/L17MT的DMSO溶液；1)将50mg/L的17MT溶液均分，每份200µL；2)均分溶液在-20°C下保存，不超过2个月。d)配制含有0.2%DMSO的50µg/L17MT的以下暴露溶液。1)空白培养基100mL；2)含17MT50mg/L的DMSO100µL；3)DMSO100µL。B.1.2开始暴露a)向每个孔中添加5个spg1-gfp转基因日本青鳉鱼胚胎；b)在胚胎不缺水的情况下移除最大量的液体（最大剩余体积800μLc)每个孔添加8mL暴露溶液；d)在黑暗中于26°C下孵育孔板。试验期间，禁止喂食。B.1.3在24h和48h更换暴露溶液a)记录死亡率，并移除所有死亡胚胎；b)根据B1.1配制暴露溶液；GB/TXXXXX—XXXXc)去除最大体积的溶液；d)每个孔添加8mL暴露溶液；e)在黑暗中于26°C下孵育孔板。试验期间，禁止喂食。B.1.472h时期润洗胚胎a)准备含有8mL水的六孔润洗板，可使每个孔中的胚胎正常生长和发育；b)将暴露组孔板中的所有胚胎转移至润洗孔板中。B.1.572h时期观察胚胎a)如必要，在六孔板的每孔暴露于50µg/L17MT的胚胎中加入2mL浓度为1g/L的MS222用于麻醉。注意一次只能麻醉一块孔板；b)放置好胚胎，使成像系统可以对背侧进行成像；c)调整荧光显微镜的变焦和聚焦，以确定允许两个肾脏成像的最大变焦；d)检查孔板上的其他胚胎，以确保所选的缩放使两个肾脏在同一幅图像中显示。否则，则重新调整缩放，重新开始该过程；e)如果可能，重置相机的白平衡；f)将相机的增益设置为零，并调整曝光时间，调整到肾脏尽可能明亮而不显白；g)如果曝光需要设置在100ms以上，以导致GFP信号饱和（GFP信号中的白色区域则增加增益并重新启动；h)检查孔板上的其他胚胎，以确保选定的暴露时间不会导致肾脏的很大一部分变白。否则，则重新调整缩放，重新开始该过程；i)保存并记录相机的选定设置，并保存设置文件，以便在以后的每次成像过程中调用；j)拍摄每个胚胎的图像；k)拍摄完所有图像后，对胚胎进行安乐死；l)按照第12章的说明对图像进行分析；m)暴露于雄激素后的胚胎的示例图像（背侧视图）见附录F。B.2测定17MT和氟他胺的线性和灵敏度确定17MT和氟他胺的线性和灵敏度。在3µg/L17MT存在的情况下，将20个胚胎暴露于一定浓度范围的17MT和一定浓度范围的氟他胺中。该步骤需要三次独立重复。B.2.1配制暴露溶液a)每个试验组由4个孔组成，每孔5个spg1-gfp转基因日本青鳉鱼胚胎；b)所有孔中DMSO的最终浓度为0.2%；c)配制10mg/L17MT的DMSO溶液；-将10mg/L17MT溶液均分，每份溶液为200µL；-均分的溶液在-20°C下保存，不超过2个月。d)配制500mg/L氟他胺溶于DMSO的溶液。-将500mg/L氟他胺溶液均分，每份溶液200µL；-将均分的溶液在-20°C下保存，不超过2个月。根据以下内容配制试验溶液：GB/TXXXXX—XXXX无无无无3表B.1试验溶液和中间溶液的配制B.2.2试验组为：溶剂对照：含0.2%DMSO的培养基含0.2%DMSO的17MT1.5µg/L含0.2%DMSO的17MT3µg/L含0.2%DMSO的17MT10µg/L氟他胺18.5µg/L+含0.2%DMSO的17MT3µg/L氟他胺55.6µg/L+含0.2%DMSO的17MT3µg/L氟他胺167µg/L+含0.2%DMSO的17MT3µg/L氟他胺500µg/L+含0.2%DMSO的17MT3µg/LB.2.3开始暴露a)在每孔添加5个spg1-gfp转基因胚胎；b)在胚胎不缺水的情况下移除最大体积的液体（最大剩余体积800μLc)继续处理对照组、17MT组和17MT+氟他胺组；d)每个孔添加8mL暴露溶液；e)在黑暗中于26°C下孵育孔板。试验期间，禁止喂食。B.2.3.1在24h和48h更新暴露液a)记录死亡率，并移除所有死亡胚胎；b)根据B2.1配制暴露溶液；c)使用软移液管移除最大体积的液体；d)每个孔添加8mL暴露溶液；e)在黑暗中于26°C下孵育孔板。试验期间，禁止喂食。GB/TXXXXX—XXXXB.2.3.2在72h润洗胚胎a)准备六孔润洗板，每孔含有8mL脱氯水或矿泉水；b)将暴露组的所有胚胎从暴露板转移到润洗板；c)将润洗板运送至将进行读数的位置。B.2.3.3在72h观察胚胎a)加载第一步校准试验结束时保存的图像拍摄参数；b)如有必要，在六孔板的每孔中加入2mL浓度为1g/L的MS222，麻醉暴露于溶剂对照溶液的胚胎；c)注意一次只能麻醉一块孔板；d)如果需要，在麻醉开始后（1至5min将胚胎转移到用于成像的载体上，如黑色塑料表面或透明底部黑色96孔板；e)放置好胚胎，以便成像系统可以对背侧进行成像；f)拍摄每个胚胎的图像；g)在拍摄暴露组的所有图像后，对胚胎进行安乐死；h)继续拍摄，直到完成所有组的拍摄；i)按照第12章的说明分析图像。B.2.4结果分析a)汇总数据进行统计分析并绘制图表，应注意17MT和氟他胺的最低LOEC；b)17MT的LOEC应至少为3µg/L，氟他胺的LOEC至少为500µg/L；c)17MT和氟他胺应在浓度试验范围内应呈现浓度-响应关系；d)如果由于低浓度时灵敏度低或较高浓度时信号饱和，和浓度-响应关系不明显，则应尽量调整图像拍摄参数以改善浓度-响应关系。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）收集胚胎：驯化和批量收集试验所需胚胎最迟应在试验开始前3d收集，以便恢复和适应；从接收胚胎到暴露开始时间内，死亡或异常胚胎数量少于总数的20%时，才可收集该批胚胎。试验开始前三天收集胚胎方法：a)不同受精日期的胚胎不得混用；b)对胚胎进行分类，以去除死亡和异常胚胎且应少于20%，否则该批次不适用于本文件试验；c)将正常胚胎转移到1L晶体容器或15cm培养皿中，培养皿中装有适合培养日本青鳉胚胎的培养基（见附录Dd)每个晶体容器的最大密度为500个胚胎，每个培养皿的最大密度是200个胚胎；e)在约26℃的温度和14h:10h的光暗周期下孵育胚胎。根据需要调整孵化温度，控制胚胎在9dpf或10dpf时期左右孵化最佳（胚胎在7-12dpf期间孵化均符合实验开展要求f)试验所需胚胎为0dph时期胚胎，但允许0dph时期胚胎有不同的受精天数。在单次重复试验中，所有实验胚胎的受精天数差异不应超过一天。应随机选用胚胎到不同暴露组中；g)在胚胎发育至孵化期间，胚胎培养基应至少更换一次。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）日本青鳉胚胎孵化所需的培养基化学特性表D.1适合青鳉胚胎孵化的培养基参数要求--GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）鉴别正常与异常游离胚胎的拍摄方法图E.1识别正常和异常胚胎的拍摄方法(A)正常游离胚胎；异常胚胎包括B）胚胎较小，长度明显比同批次的其他胚胎短；(C)部分孵化，胚胎尚未完全从卵中孵出D和E）发育不良，孵化的青鳉胚胎都表现出非常大的卵黄囊，但仍呈球形；(F)畸形，尾巴向下弯曲。比例尺为1mm。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）胚胎定位图F.1用于成像的胚胎的预期定位如果胚胎的位置允许对背侧区域（包括肾脏的位置）进行成像，则该定位是正确的。图F.1A)和B）为两个spg1-gfp青鳉胚胎背侧图像，胚胎肾脏中显示绿色荧光蛋白(GFP)信号。胚胎朝向图像的右侧。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）试验数据的统计分析方法采用的统计方法首先要进行D'Agostino-Pearson正态性检验以确定每个暴露组的数据是否呈正态分布。为确定方差是否均匀，应进行方差齐性检验（如Levene检验）。如果数据呈正态分布且不违反方差齐性假设，则应对未加标模式下的受试物处理组和空白对照（若未使用溶剂，溶剂对照或试验介质对照）进行ANOVA检验，然后进行Dunnett’spost-hoc检验。同样，应对加标模式下的受试物处理组和17MT3µg/L对照进行ANOVA检验，然后进行Dunnett’spost-hoc检验。如果数据符合正态分布但方差非齐次，则应执行Kruskal-Wallis检验，然后执行Dunnett’spost-hoc或Welchsl多对一比较检验。如果数据不符合正态分布，则应对未加标模式下的受试物处理组和空白对照（若未使用溶剂，溶剂对照或试验介质对照）进行Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunnett’spost-hoc检验。同样，应对加标模式下的受试物处理组和17MT3µg/L对照进行Kruskal-Wallis检验，然后进行Dunnett’spost-hoc检验。图G.1比较两组及以上的试验结果统计分析流程另外，如果在试验期间记录了孔内信息，也可以使用嵌套ANOVA试验（也称为混合ANOVA）来分析这类数据，其中的随机效应项应考虑到运行或孔内带来的可变性。随后进行事后检验如Dunnett’s检验，以确定差异的大小和显著性。如果仅比较两组数据，例如3µg/L17MT激动剂对照组和3µg/L17MT+500µg/L氟酰胺拮抗剂对照组，则应首先通过D'Agostino-Pearson正态性检验，以确定每个暴露组的数据是否为正态分布。如果每个暴露组的数据均为正态分布，则应进行Welch校正的student-t检验。如果一个或两个暴露组的数据不符合正态分布，应进行Mann-Whitney检验。GB/TXXXXX—XXXX（资料性附录）关于SPG1-GFP品系日本青鳉的获取关于spg1-gfp青鳉转基因品系的获取，可以通过WatchFrog以及相关实验室获取该品系，这些实验室包括TEFOR,France;TheNationalBioResourceProject,Japan;IDEAConsulting,Japan;TheNationalMuseumofNaturalHistory,France，ibaconGmbH、Eurofins、CharlesRiver和Scymaris等。使用该品系鱼类需要同相关实验室签署协议。GB/TXXXXX—XXXX参考文献[1]Borg,B.,Antonopoulou,E.,Andersson,E.,Carlberg,T.,Mayer,I.1993.Effectivenessofseveralandrogensinstimulatingkidneyhypertrophy,asecondarysexualcharacter,incastratedmalethreespinedsticklebacks,Gasterosteusaculeatus.Can.J.Zool.7,2327–2329.[2]Cui,J.,Shen,X.,Yan,Z.,Zhao,H.,andNagahama,Y.(2009).Homology-modeledligand-bindingdomainsofmedakaestrogenreceptorsandandrogenreceptors:amodelsystemforthestudyofreproduction.Biochem.Biophys.Res.Commun.380,115–121.[3]Hahlbeck,E.,Katsiadaki,I.,Mayer,I.,Adolfsson-Erici,M.,James,J.,andBengtsson,B.-E.(2004).Thejuvenilethree-spinedstickleback(GasterosteusaculeatusL.)asamodelorganismforendocrinedisruptionII--kidneyhypertrophy,vitellogeninandspiggininduction.Aquat.Toxicol.70,311–326.[4]Horie,Y.,Watanabe,H.,Takanobu,H.,Yagi,A.,Yamagishi,T.,Iguchi,T.,andTatarazako,N.(2017).Developmentofaninvivoanti-androgenicactivitydetectionassayusingfenitrothioninJapanesemedaka(Oryziaslatipes).J.Appl.Toxicol.37,339–346.[5]HornungM.W.,CookP.M.,FitzsimmonsP.N.,KuehlD.W.,NicholsJ.W.(2007).Tissuedistributionandmetabolismofbenzo[a]pyreneinembryonicandlarvalmedaka(Oryziaslatipes).Toxicol.Sci.100,393–405.[6]Hutchinson,T.H.,Shillabeer,N.,Winter,M.J.,andPickford,D.B.(2006).Acuteandchroniceffectsofcarriersolventsinaquaticorganisms:Acriticalreview.Aquat.Toxicol.[7]Iwamatsu,T.(2004).StagesofnormaldevelopmentinthemedakaOryziaslatipes.Mech.Dev.121,605–618.Iwamatsu,T.,Kobayashi,H.,andYamashita,M.(2006).Sexreversalinmedakatreatedinvitrowith17α-methyldihydrotestosteroneduringoocytematuration.Dev.GrowthDiffer.48,59–64.[8]Jakobsson,S.,Borg,B.,Haux,C.,andHyllner,S.J.(1999).An11-ketotestosteroneinducedkidneysecretedprotein:thenestbuildinggluefrommalethree-spinedstickleback,Gasterosteusaculeatus.FishPhysiol.Biochem.20,79–85.[9]Jolly,C.,Katsiadaki,I.,Morris,S.,LeBelle,N.,Dufour,S.,Mayer,I.,Pottinger,T.G.,andScott,A.P.(2009).Detectionoftheanti-androgeniceffectofendocrinedisruptingenvironmentalcontaminantsusinginvivoandinvitroassaysinthethree-spinedstickleback.Aquat.Toxicol.92,228–239.[10]KashiwadaS.,GokaK.,ShiraishiH.,ArizonoK.,OzatoK.,WakamatsuY.,HintonD.E.(2007).AgedependentinsituhepaticandgillCYP1Aactivityinthesee-throughmedaka(Oryziaslatipes).Comp.Biochem.Physiol.CToxicol.Pharmacol.145,96–102.[11]Katsiadaki,I.,Morris,S.,Squires,C.,Hurst,M.R.,James,J.D.,andScott,A.P.(2006).Useofthethreespinedstickleback(Gasterosteusaculeatus)asasensitiveinvivotestfordetectionofenvironmentalantiandrogens.Environ.HealthPerspect.114Suppl1,GB/TXXXXX—XXXX[12]Katsiadaki,I.,Scott,A.P.,Mayer,I.2002a.PotentialofthesticklebackasacombinedbiomarkerforestrogensandandrogensinEuropeanwaters.Mar.Environ.Res.54,[13]Katsiadaki,I.,Scott,A.P.,Hurst,M.R.,Matthiessen,P.,Mayer,I.200b.Detectionofenvironmentalandrogens:anovelmethodbasedonenzyme-linkedimmunosorbentassayofspiggin,thestickleback(Gasterosteusaculeatus)glueprotein.Environ.Toxicol.Chem.21,[14]Kawahara,R.,andNishida,M.(2007).Extensivelineage-specificgeneduplicationandevolutionofthespigginmulti-genefamilyinstickleback.BMCEvol.Biol.7,209.[15]Kinoshita,M.,Murata,K.,Naruse,K.,andTanaka,M.(2009).Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols(JohnWiley&Sons).[16]Kiparissis,Y.,Metcalfe,T.L.,Balch,G.C.,andMetcalfe,C.D.(2003).Effectsoftheantiandrogens,vinclozolinandcyproteroneacetateongonadaldevelopmentintheJapanesemedaka(Oryziaslatipes).Aquat.Toxicol.63,391–403.[17]Kullman,S.W.,andHinton,D.E.(2001).Identification,characterization,andontogenyofasecondcytochromeP4503Agenefromthefreshwaterteleostmedaka(Oryziaslatipes).Mol.Reprod.Dev.58,149–158.[18]Masuyama,H.,Yamada,M.,Kamei,Y.,Fujiwara-Ishikawa,T.,Todo,T.,Nagahama,Y.,andMatsuda,M.(2012).Dmrt1mutationcausesamale-to-femalesexreversalafterthesexdeterminationbyDmyinthemedaka.ChromosomeRes.20,163–176.[19]Matsuda,M.,Nagahama,Y.,Shinomiya,A.,Sato,T.,Matsuda,C.,Kobayashi,T.,Morrey,C.E.,Shibata,N.,Asakawa,S.,Shimizu,N.,etal.(2002).DMYisaY-specificDM-domaingenerequiredformaledevelopmentinthemedakafish.Nature417,559–563.[20]Murata,K.,Kinoshita,M.,Naruse,K.,Tanaka,M.,andKamei,Y.(2019).Medaka:Biology,Management,andExperimentalProtocols(JohnWiley&Sons).Muschket,M.,DiPaolo,C.,Tindall,A.J.,Touak,G.,Phan,A.,Krauss,M.,Kirchner,K.,Seiler,T.-B.,Hollert,H.,andBrack,W.(2018).Identificationofunknownantiandrogeniccompoundsinsurfacewatersbyeffect-directedanalysis(EDA)usingaparallelfractionationapproach.Environ.Sci.Technol.52,288–297.[21]Nakamura,A.,Takanobu,H.,Tamura,I.,Yamamuro,M.,Iguchi,T.,andTatarazako,N.(2014).VerificationofresponsesofJapanesemedaka(Oryziaslatipes)toanti-androgens,vinclozolinandflutamide,inshort-termassays.J.Appl.Toxicol.JAT34,545–553.[22]OECD(1992),TestNo.301:ReadyBiodegradability,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section3,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070349-en.[23]OECD(1998),TestNo.212:Fish,Short-termToxicityTestonEmbryoandSac-FryStages,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264070141-en.[24]OECD(2006).CurrentApproachesintheStatisticalAnalysisofEcotoxicityData:AGuidancetoApplication,SeriesonTestingandAssessmentNo.54,OECD,Paris.GB/TXXXXX—XXXX[25]OECD(2009),TestNo.230:21-dayFishAssay:AShort-TermScreeningforOestrogenicandAndrogenicActivity,andAromataseInhibition,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264076228-en.[26]OECD(2010a).ValidationReportofthe21-DayAndrogenisedFemaleSticklebackScreeningAssay,SeriesonTestingandAssessmentNo.128,OECD,Paris.OECD(2011a).GuidanceDocumentontheAndrogenisedFemaleSticklebackScreen,SeriesonTestingandAssessmentNo.148,OECD,Paris.[27]OECD(2011b),TestNo.234:FishSexualDevelopmentTest,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264122369-en.[28]OECD(2012),TestNo.229:FishShortTermReproductionAssay,OECDGuidelinesfortheTestingofChemicals,Section2,OECDPublishing,Paris,/10.1787/9789264185265-en.[29]OECD(2013),TestNo.210:Fish,Early-lifeStag