化学品 水-沉积物系统中穗状狐尾藻毒性试验 征求意见稿

5GB/TXXXXX—XXXX化学品水-沉积物系统中穗状狐尾藻毒性试验本文件描述了化学品水-沉积物系统中狐尾藻毒性试验的术语、试验原理、受试物信息、参比物、试验材料和条件、试验程序、质量保证与质量控制、数据处理、结果报告。本文件适用于评价化学品尤其是具有除草活性的化学品对生长在水-沉积物标准介质（水、沉积物和营养液）中的根系水生植物穗状狐尾藻活力的影响。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T21801化学品快速生物降解性呼吸计量法试验GB/T21802化学品快速生物降解性改进的MITI试验（I）GB/T21803化学品快速生物降解性DOC消减试验GB/T21831化学品快速生物降解性密闭瓶法试验GB/T21845化学品水溶解度试验GB/T21852化学品分配系数（正辛醇―水）高效液相色谱法试验GB/T21853化学品分配系数（正辛醇―水）摇瓶法试验GB/T21855化学品与pH有关的水解作用试验GB/T21856化学品快速生物降解性二氧化碳产生试验GB/T21857化学品快速生物降解性改进的OECD筛选试验GB/T22052用液体蒸气压力计测定液体的蒸气压力温度关系和初始分解温度的方法GB/T22228工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-1Pa至105Pa范围内的测定静态法GB/T22229工业用化学品固体及液体的蒸气压在10-3Pa至1Pa范围内的测定蒸气压平衡法GB/T27850化学品快速生物降解性通则GB/T42426化学品蒸气压试验OECD化学品测试导则No.112水中解离常数（DissociationConstantsinWater）OECD化学品测试导则No.310快速生物降解―密闭瓶二氧化碳法（顶空试验ReadyBiodegradability―CO2inSealedVessels(HeadSpace)］OECD化学品测试导则No.316化学品在水中的光转化直接光解试验（PhototransformationofChemicalsinWater―DirectPhotolysis）3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1水-沉积物系统water-sedimentsystem在实验室利用水相培养基和人工土建立的水-沉积物试验系统。6GB/TXXXXX—XXXX3.2测量变量measurementvariable在试验过程中被测量或被记录的变量，指穗状狐尾藻的整株植物的茎长、茎鲜重和茎干重。3.3平均比生长率averagespecificgrowthrate试验期间穗状狐尾藻测量变量的对数增长率，用μ表示。3.4生物量增长量yield试验期间穗状狐尾藻茎长、茎鲜重和干重的变化，即一定试验周期内（如14d）最终测量值与最初测量值之差。3.5响应变量responsevariable；穗状狐尾藻的平均比生长率和生物量增长量。4试验原理将健康、未开花的穗状狐尾藻的顶芽种植于标准培养基中，待根系形成后，将植物暴露于一系列受试物浓度或者加标沉积物中，在受控的环境条件下连续培养14天。受试物对植物生长的影响可通过茎长、茎鲜重和茎干重的定量评估，以及对黄化、坏死或生长畸形等症状的定性观察来确定。通过茎长、茎鲜重和茎干重计算平均比生长率和生物量增长量，由平均比生长速率（r）和增长量（y）分别确定ErCx（例如ErC10、ErC20、ErC50）和EyCx（例如EyC10、EyC20、EyC50根据需要可通过平均比生长率和生物量增长量获得最低观察到的效应浓度（LOEC）和无观察到的效果浓度（NOEC）。5受试物信息受试物信息包括：a)按照GB/T21845方法测定的水中溶解度；b)按照GB/T21852或GB/T21853方法测定的正辛醇-水分配系数或关于分配行为的其他信息；c)按照GB/T21855方法测定的水解作用或按照OECD化学品测试导则No.316测定的光稳定性或在试验用水/试验介质中的稳定性；d)按照GB/T22052、GB/T22228、GB/T22229、GB/T42426方法测定的蒸气压；e)关于生物或非生物降解性的信息，如按照GB/T21801、GB/T21802、GB/T21803、GB/T21831、GB/T21856、GB/T21857、GB/T27850或OECD化学品测试导则No.310测定的快速生物降解性试验结果；f)酸解离常数，如按照OECD化学品测试导则No.112测定的水中解离常数；g)应具备已知准确度、精密度和灵敏度的分析方法，明确体系中受试物的定量限，并提供详细的样品前处理和储存方法。7GB/TXXXXX—XXXX6参比物定期使用参比物如3,5-二氯苯酚（3,5-DCP）检查试验程序的有效性。验证试验数据表明，3,5-DCP对穗状狐尾藻不同响应变量的平均EC50值在4.7mg/L～6.1mg/L范围内。建议每年至少对参比物开展2次试验，如果测试频率较低，可在进行正式毒性试验的同时进行参比物试验，确保试验方法的有效性。7试验材料和条件7.1仪器设备除常规实验室仪器设备外，还需要以下设备：a)人工气候培养箱或生长室，其日照长度、光照和温度应可控；b)分析天平；c)pH计；d)溶解氧测定仪；e)温湿度记录仪；f)照度计；g)玻璃缸或玻璃烧杯（推荐规格：2L烧杯，高约24cm，直径约11cm），试验容器应有足够的水深满足植物无限生长，并使植物在整个试验期间浸没在水中，其他较大的容器也可适用，其尺寸大小应与设计的试验体系相符合；h)塑料或玻璃培养钵，其尺寸大小应与设计的试验体系相符合（在测试疏水性物质或正辛醇-水分配系数较高的物质时宜选用玻璃材质，推荐体积：约500mL，高约8cm，直径约9cmi)烘干箱。7.2试验生物狐尾藻植株可从野外采集、水生植物供应商购买和实验室繁殖获得，关于狐尾藻的具体描述见附录A。如果来源于野外或购买获得，应记录植物的来源，并核实物种身份。当从野外采集狐尾藻时，应确保获得正确的物种，特别当采集地是与其他多叶藻杂交的地区时。建议使用经过验证的已知来源的实验室培养物，不宜使用污染过的或从已知被污染的地方收集的植物。在试验前，植物应在与试验条件相似但不一定完全相同的条件下培养/驯化一段时间（如大于2周）。开花的培养植物不应用于试验，因为其在开花期间和开花后营养生长速率普遍下降。7.3试验条件在实验中使用暖和或冷白荧光灯来提供光辐照度（波段范围为400nm～700nm），水面光照强度为120μE/（m2•s）～160μE/（m2•s），在实验区域内光照强度的任何偏差不应超过±15%。光照和黑暗的时间比为16h：8h，试验水温控制在18℃~22℃范围内，植物生长的最佳pH范围为7.5～8.0。在试验过程中对照组pH的增加不应超过1.5个单位，而当可以证明满足规定的有效性标准时，pH变化超过1.5个单位的偏差不影响试验的有效性。8试验程序8.1试验体系的设计8.1.1试验对照组应包含至少6个平行的试验容器；试验设置至少5个浓度，每个浓度应包含至少48GB/TXXXXX—XXXX个平行的试验容器。如果不需要测定NOEC，可以改变试验设计，增加浓度和减少每个浓度的平行数。8.1.2每个试验容器代表1个包含3个顶芽的平行。有下列方法可以确保每个容器中有3株顶芽：a)试验设计A：1株顶芽/培养钵，3个培养钵/试验容器；b)试验设计B：3株顶芽/培养钵，1个培养钵/试验容器；c)可接受每个培养钵1株顶芽，每个容器1个培养钵的试验设计，但需对平行数进行调整以达到所需的有效性标准。8.1.3每个试验容器应随机分配到不同的处理组，对试验区域中试验容器的位置进行随机设计，以尽量减少光照强度或温度的空间差异造成的影响。8.2试验浓度的设计8.2.1浓度通常遵循几何级数，试验浓度之间的间隔系数不应超过3.2，根据预试验的结果选择合适的浓度范围。8.2.2为了确定ECx，试验浓度应包含ECx以确保适当的置信水平。例如，最高试验浓度应大于EC50的预估值。如果EC50值在试验浓度范围之外，相关的置信区间范围将较大，可能无法对模型的统计拟合进行有效评估，设置更多的试验浓度有利于获得高质量的ECx值置信区间。8.2.3为了确定LOEC/NOEC(可选终点)，最低试验浓度应足够低，以确保处理组植株的生长与对照组无显著性差异。此外，最高试验浓度应足够高，使处理组植株的生长显著低于对照组。设置更多的平行有利于提高方差分析的统计能力。8.3限度试验8.3.1当预试验表明,在受试物浓度高达100mg/L或受试物在试验培养基中达到其溶解度极限或可分散性极限的情况下对生长无不利影响时，可将100mg/L或受试物溶解度极限或1000mg/kg干沉淀物作为试验浓度，开展包括1个试验组和1个对照组在内的限度试验。建议将每个对照组和试验组的平行数量增加至不少于6个试验容器。对照组和试验组的植物增长可使用如Student'st检验比较平均值。8.4试验溶液的配制8.4.1通过稀释贮备液的方法配制试验溶液，将受试物溶解或分散在Smart–Barko培养基中，使用蒸馏水或去离子水配制。8.4.2最高试验浓度通常不应超过受试物的水溶解度，针对制剂类的受试物，最高试验浓度不应超过试验条件下该物质的分散性。8.4.3对低水溶性的受试物，可能需要使用有机溶剂或分散剂配制贮备液以便将受试物精确地添加到试验介质中并帮助其分散和溶解，但应尽一切努力避免使用助溶剂或分散剂。使用助溶剂或分散剂不应产生植物毒性，常用的助溶剂在浓度达到100μL/L时不会引起植物毒性，如丙酮和二甲基甲酰胺。如果使用助溶剂或分散剂，应报告其最终浓度并保持在最低水平（不大于100μL/L）。此时，所有的处理组和溶剂对照组都应包含相同浓度的助溶剂或分散剂，不含助溶剂或分散剂的未经处理的空白对照组也需纳入到试验设计中。关于助溶剂或分散剂的使用指导可参考OECDNo.23。8.5预培养阶段8.5.1从植株上剪下健康的芽尖/顶芽，无侧枝，长度为5cm～6cm。对于试验设计A(1株顶芽/培养钵，3个培养钵/试验容器)，在每个培养钵内植入1株穗状狐尾藻顶芽；对于试验设计B(3株顶芽/培养钵，1个培养钵/试验容器)，在每个培养钵内种植4株～5株穗状狐尾藻顶芽。8.5.2在这两种情况下(8.5.1)应有足量的培养钵植入多余的顶芽以备在试验开始时选择生长一致的植物，以及提供备用植物在试验开始前用于检查根系的生长发育情况，备用植物将在第0d用于茎重量9GB/TXXXXX—XXXX和长度的测量。8.5.3顶芽被插入到沉积物表面以下约3cm，至少覆盖2个茎节。将培养钵转移至试验容器中，与试验暴露相同的环境条件下，在Smart–Barko培养基中预培养7天，以诱导根系发育。预培养结束后，应将多余植株移走，以检查根系生长情况。如果根生长不可见(即根尖不可见)，则应将预培养阶段延长，直至根生长可见，建议采取该步骤以确保植株在试验启动时处于良好的生长状态。8.5.4对于试验设计A(1株顶芽/培养钵，3个培养钵/试验容器)，在试验开始前挑选植物生长一致的培养钵；对于试验设计B(3株顶芽/培养钵，1个培养钵/试验容器)，多余的植株将被移除，留下三株大小和外观一致的植株。8.6通过水相的暴露8.6.1根据试验设计的要求，选择植物生长一致的培养钵放入试验容器中，将Smart–Barko培养基添加至试验容器中，该操作应避免扰动沉积物，为此可用漏斗加入培养基（如有需要可在此过程用塑料圆盘覆盖沉积物，倒入培养基后立即取出或者在添加培养基后，将培养钵置于试验容器中。应尽量减少藻类和细菌的潜在积聚，如果有必要可在暴露阶段开始时使用新鲜培养基。允许一次性配制好所有平行的受试物试验溶液，在测试开始时记录试验溶液的外观（如澄清、浑浊等）。8.6.2可先将相应量的受试物加入试验培养基中，也可将受试物直接加入到装有培养基的试验容器中，应注意确保受试物均匀地分布在整个测试系统中，且不扰动沉积物。8.6.3添加培养基前或后，应测量沉积物上方的茎长。8.7通过沉积物的暴露8.7.1通过直接向新鲜沉积物中添加受试物溶液制备所需浓度的加标沉积物，受试物溶解在去离子水中，通过轧机、搅拌机或手工搅拌，与配制好的沉积物充分混合。如果受试物难溶于水，可将其溶解在尽可能小体积的合适有机溶剂中（如正己烷、丙酮或氯仿），将该溶液与约10g细石英砂混合，待溶剂挥发后，将沙子与每个试验容器中适量的沉积物混合，只有易挥发的溶剂才可用于溶解、分散或乳化受试物。在最终制备沉积物时，应考虑掺有受试物的沙子的体积/重量（即沉积物应使用较少的沙子制备）。应确保添加到沉积物中的受试物均匀分布。8.7.2将加标的沉淀物装入培养钵中，从预培养阶段中取出生长一致且具备充足根系的植株植入到加标沉积物中。8.7.3将培养钵放入试验容器中，小心地加入Smart-Barko培养基（如使用漏斗避免扰动沉积物。8.7.4在添加培养基前或后，测量沉积物上方的芽长。8.8试验环境条件的维持和测定8.8.1应记录最终溶液体积，并在每个试验容器上标记水位。如果在测试过程中水分蒸发超过10%，则应补充蒸馏水调整水位；如有必要，可用透明盖子（如透明塑料盖）松散地覆盖容器，以尽量减少水分蒸发和藻类的污染。上覆水水深应高于沉积物顶部12cm，并应分别记录沉积物的表面积/体积和上覆水面积/体积的比值。8.8.2另外准备试验容器，加入培养基并置于相同的环境条件下，用于每天记录试验容器所在环境如培养箱、人工气候室的温度，或用温度记录仪连续记录试验环境中的温度。8.8.3至少在试验开始、试验期间和结束时，在同一时间测定所有试验容器的溶解氧和pH。如果试验开始时（0d）配制不同浓度的试验溶液分装至不同平行容器中，可只测定分装前的不同浓度试验溶液的溶解氧和pH即可。8.8.4在试验开始或试验过程中，至少进行1次光照强度的测定，应在生长箱、培养箱或房间中与容器内水位等高的位置上测定光照强度。光照强度的测定方法与传感器的类型相关，与单向传感器相比，GB/TXXXXX—XXXX球形传感器（对测量平面上方和下方的所有角度的光作出响应）和余弦传感器（对测量平面上方的所有角度的光作出响应）更有利于准确测定，并且多点光源易给出更高的读数结果。8.9生长指标的分析测定8.9.1在预培养阶段结束后至试验开始前（即第0d），从备用的植株中随机选择5个培养钵（3株/培养钵）或15个培养钵（1株/培养钵），评估茎长、茎鲜重和茎干重。8.9.2当植株植入暴露体系后，相关指标测定如下：a)至少在试验结束时（第14d），测定和记录茎长、侧枝数量和侧枝的长度；b)暴露过程中至少观察和记录3次（如0d、7d、14d)植物生长和健康状况；c)试验结束时（如第14d），测定和记录茎的鲜重和干重。8.9.3可使用尺子测量茎长，如果存在侧枝，同时记录侧枝的数量和长度。试验过程中观察和记录植物的外观和试验培养基的状况以对植物的健康状况进行评估。观察结果包括：a)黄化，坏死或者其他变色现象如与对照组植株相比过度变红；b)细菌或藻类污染；生长异常，如发育迟缓、节间长度改变、茎/叶扭曲、侧芽增殖、叶片损失、膨大体损失和茎断裂；c)试验结束时，仔细清洗根部的沉积物以对根部系统的健康状况进行评估，与对照组相比，是否存在根系缺失、减少、中度发育或与对照接近较好的发育情形。8.9.4在试验的开始和结束时，对茎鲜重进行评估。在沉积物水平上切割枝条，小心去除可能粘附在芽基部的沉积物颗粒，吸干水分后称鲜重，将植株放入约60℃干燥箱中烘干至恒重，称量并记录干重。相关指标的具体测定时间见表1。表1相关指标测定的时间表0√√√√4――――7―√―√√√√√8.10受试物浓度分析8.10.1应通过受试物浓度的分析来确定受试物的正确施用量。在试验开始后不久（稳定的受试物于试验当天，不稳定的受试物于试验开始1h内），以及在试验结束时，采集水样进行浓度分析。8.10.2在试验开始和试验结束时测定沉积物和沉积物孔隙水中的受试物浓度，至少测定最高试验浓度，除非已知受试物在水中稳定（大于理论浓度的80%）。如果已有水–沉积物在类似条件下（例如沉积物与水的比例、使用方法、沉积物类型）的研究明确表明受试物在水–沉积物之间的分配行为，则无需对沉积物和孔隙水进行浓度分析。GB/TXXXXX—XXXX8.10.3在试验开始时对沉积物取样很可能会破坏试验系统，因此需要额外的试验容器用于试验开始和结束时的浓度分析。如果认为有必要进行中期评估，如在第7d进行评估，而分析需要大量难以从测试系统中获取的沉积物样本，则应设置额外的试验容器用于分析测定。额外试验容器的准备方式与生物评估所用的试验容器方式相同。8.10.4可采用10000g，4℃离心30min获得间隙水，如果已证明受试物不被滤膜吸附，也可采用过滤的方式。如果样本量太小，可能无法分析孔隙水中的受试物浓度。8.10.5如果受试物浓度在试验期间不能保持在理论浓度的±20%范围内，应开展半静态试验（如水相暴露在每次更换溶液时，应对新配制的试验溶液和旧试验溶液进行采样和受试物浓度分析。如果受试物的初始实测浓度不能达到理论浓度的±20%，但有证据表明初始浓度是可重复和稳定的（即在初始浓度的80%～120%范围内），可只对最高和最低的试验组进行浓度测定。8.10.6只需对每个浓度下的1个平行容器进行受试物浓度的测定，也可将每个浓度所有平行的试验溶液混合后用于浓度分析。8.10.7如果已有证据表明，在整个试验过程中，受试物的实测浓度能够保持在理论浓度或初始浓度的±20%范围内，可基于理论浓度或初始浓度进行数据处理和毒性终点的估算，此时效应浓度应基于理论浓度或测定的初始浓度。如果有证据表明受试物浓度在试验过程中出现了下降（即在处理组中不能保持在理论浓度或初始浓度的±20%以内），应基于暴露期间实测浓度的时间加权平均值或受试物浓度下降模型对结果进行统计，更多的关于受试物效应浓度的计算可参考OECDNo.23。9质量保证与质量控制如满足以下条件，试验结果有效。a)试验期间，对照组的平均总茎长和茎总鲜重至少是试验开始时的2倍。b)对照组植物不得出现任何黄化的症状，沉积物和试验培养基无明显藻类和/或细菌等其他生物的污染。c)从试验开始到试验结束，对照组平行之间植物茎鲜重生物量变异系数的平均值不超过35%。10数据统计10.1响应变量10.1.1如果使用了助溶剂或分散剂，助溶剂对照组和空白对照组的结果在统计上无显著性差异时，助溶剂对照组和空白对照组的数据可合并用于统计分析。采用平均比生长率和生物量增长量两个响应变量评估受试物对植物生长的影响。10.1.2平均比生长率是基于对照组和每个处理组的总茎长、总茎鲜重和总茎干重随时间的对数变化。对照组和处理组的每个平行均需统计，按照公式(1)计算每个试验容器（平行）的3株植物的平均长度和重量以及随后每个平行的生长速率。μi−j=…………（1）式中：——从i时间到j时间的平均比生长率；Ni——在时间i时处理组或对照组的测量变量；Nj——在时间j时处理组或对照组的测量变量；GB/TXXXXX—XXXXt——从i到j的时间，单位为天(d)。10.1.3应计算整个试验周期每个处理组和对照组中的生长率平均值和方差值，按照公式(2)计算每个试验浓度（处理组）的生长抑制百分率（Ir）。×100…………(2)式中：Ir——平均比生长率的抑制率，单位为百分率(%);μc——空白对照组的平均比生长率；μt——处理组的平均比生长率。10.1.4基于对照组和每个处理组总茎长、总茎鲜重和总茎干重随时间的变化，按照公式（3）计算生物量增长量抑制百分率（Iy）。%Iy=×100…………（3）式中：Iy——生物量抑制百分率，单位为百分率(%);bc——空白对照组最终生物量与初始生物量之差；bt——处理组的最终生物量与初始生物量之差。10.2浓度–效应曲线10.2.1根据上述的穗状狐尾藻的平均比生长率抑制率（Ir）和生物量增长量抑制率（Iy）绘制受试物的浓度对数-效应曲线。10.2.2基于总茎鲜重、总茎干重和总茎长的平均比生长率（ErCx）和生物量增长量（EyCx）分别估算ECx。应该注意的是，使用这两个响应变量计算获得的ECx值不具有可比较性。由于各自方法的数学基础不同，在遵守本文件测试条件下，基于平均比生长率的ECx值（ErCx）在大多数情况下高于基于生物量的ECx值（EyCx这种差异不是两个响应变量之间的敏感性差异，仅在数值上存在区别。10.2.3通过回归分析获得定量的浓度-响应关系，在对响应数据进行线性化转换后，可使用加权线性回归，例如将其转换为probit、logit或Weibull单位，但非线性回归是处理数据不规则和偏离平滑分布的首选方法，接近零抑制或完全抑制时，这种不规则会被转换放大，干扰统计分析。probit、logit或Weibull转换的标准分析方法适用于不连续的数据（如死亡率或生存率而更多关于如生长率或生物量之类的连续数据的转换方法可参考指南文件OECDNo.54。10.2.4对于每个需要分析的响应变量，使用浓度-响应关系计算ECx值的点估计值，确定其95%置信限，并应以图形或统计的方式评估响应数据对回归模型的拟合度。回归分析应使用每个平行的效应值，而不是处理组的平均值。如果可用的回归模型/方法对数据不适用，也可使用线性插值方法获得EC50值和置信限。10.2.5使用方差分析方法（ANOVA）对每个处理组的平均值与空白组的平均值进行比较，通过适当的比较方法（如Dunnett´s,Williams´stest）获得LOEC和NOEC。采用Shapiro-Wilks-test或Levene´stest统计方法，通过方差分析假设正态分布和方差齐性是否成立，不满足正态分布和方差齐性的假GB/TXXXXX—XXXX设可通过数据的对数变换来校正。如果方差不齐和/或与偏离正态分布，且不能通过变换加以校正，则应考虑采用Bonferroni-Welch-test、step-downJonkheereTerpstratest、Bonferroni-Median-Test等方法进行分析。11结果报告试验报告应包括以下内容。a)受试物：1)单组分物质：物理性状、水溶解性及相关的物理化学性质；化学标识，如国际纯粹与应用化学联合会（IUPAC）名称或CAS名称、CAS号、简化分子线性输入规范（SMILES）码或国际化合物标识（InChI）码、结构式、纯度等信息，在适当情况下还应提供杂质的化学鉴别信息；2)多组分物质、不明复杂物质（UVCBs组分未知或者可变的物质、复杂反应产物或者生物材料）和混合物：尽可能提供各组分的化学鉴别信息（如上）、含量和相关的物理-化学特性；b)测试物种：科学名称和来源。c)试验条件：1)培养阶段的条件和周期；2)试验方式（如静态、半静态、脉冲式）；3)试验开始的时间和周期；4)试验培养基的组成，如沉积物和液体营养成分；5)试验的设计，如植物生长的空间/实验室、试验容器、试验体积、试验开始时每个试验容器植物的长度和重量、沉积物和水的表面积比、沉积物和水的体积比；6)试验浓度（理论浓度或者实测浓度），每个浓度处理组的平行数；7)受试物贮备液和试验溶液的配制方法，使用的助溶剂或分散剂（如有）；8)试验温度；9)光照源，辐照强度；10)试验开始和结束时的pH，溶液状态；11)溶解氧；d)分析方法：测定长度、鲜重和干重的方法。e)统计方法：使用合适的分析方法评估数据的质量，检验方法、分析的标准偏差或置信区间。f)结果：1)根据表1中提供的评估时间表，在每次观察和分析时，每个处理组和对照容器中植物/培养钵的茎长和茎鲜重以及其他测量变量；2)每个测量变量的平均值和标准偏差；3)每个浓度的生长曲线；4)基于茎长和鲜重的双倍对照生长速率，包括生物鲜重增长量的变异系数；；5)计算每个处理组响应变量，包括不同平行之间的平均值和变异系数；6)浓度-效应关系图；7)估算响应变量（如EC50）的毒性终点和相关置信区间，如果计算LOEC和/或NOEC，提供统计方法。8)如果使用了方差分析，则可以检测到的效应大小（例如最小显著差异）；9)浓度组可观察到的任何生长刺激效应；GB/TXXXXX—XXXX10)任何可见的植物毒性迹象以及对试验溶液的观察；11)讨论结果，包括偏离本文件对测试结果的任何影响。GB/TXXXXX—XXXXA穗状狐尾藻的描述A.1本文件中描述的方法主要针对穗状狐尾藻，也可用于测试一系列水生植物物种。穗状狐尾藻属于双子叶植物纲，小二仙草科，是一种多年生沉水植物。穗状狐尾藻为世界广泛分布，产于全球的淡水水域，可以耐受各种条件，在静态和流动的水体中均可生长。A.2冬天枝叶枯萎，根部埋在沉积物中，来年春天再次发芽生长。狐尾藻植株通常能自由开花和结果，从自然脱落的断枝或根状茎进行无性繁殖，是狐尾草繁殖的主要方法。A.3冬季不容易获得狐尾藻的地区，可能需要在温室或实验室条件下长期贮备培养。虽然可降低辐照度和温度以减少培养液更新的频率（例如当一段时间内没有计划进行狐尾藻试验时但贮备培养物应保持在与试验条件相似的条件下，且建议使用比试验中更大的水族箱或培养钵，以留出足够繁殖空间。沉积物和水介质的组成应与试验中使用的相同，也可使用其他沉积物施肥的方法（例如使用商业缓释肥A.4贮备培养物应不受到任何其他生物体的污染，包括蜗牛、丝状藻类、真菌和昆虫，如：飞蛾的卵或幼虫以及象甲的幼虫或成虫，有必要用淡水冲洗植物以消除可见的污染。此外，尽管植物不需要完全无菌，应尽量减少单细胞藻类和细菌的污染。应对贮备培养的植物进行检测，必要时进行移植，以避免藻类和细菌污染的发展。当藻类或细菌污染成为问题时，对贮备培养系统进行通气可能起到效果。GB/TXXXXX—XXXX培养基和沉积物的配制B.1Smart-Barko培养基宜使用Smart-Barko培养基培养穗状狐尾藻和进行毒性试验，用去离子水或蒸馏水配制Smart-Bar