义翘讲堂《高通量SPRBLI技术在药物大规模筛选和表征中的应用》

王旭曼高级质控经理北京义翘神州科技股份有限公司高通量SPR/BLI技术在药物大规模筛选及表征中的应用CONTENT义翘神州123高通量筛选技术在药物研发进程中的应用及重要性SPR/BLI技术原理、优势及应用高通量SPR/BLI应用案例分享01义翘神州高通量筛选技术在药物研发进程中的应用及重要性义翘神州药物研发流程药物靶点研究

药物设计

结构优化

活性筛选药物制备研究

药代动力学

药物安全性

毒理学研究

Ⅰ期临床Ⅱ期临床Ⅲ期临床新药申请批准上市上市后监测药物研发阶段临床前研究新药发现临床研究新药上市药物筛选105~106个分子<10个分子1个药物101~102个分子3-6年6-7年0.5-2年周期药物研发周期长，成本高工作量大，成功率低义翘神州高通量筛选技术高通量筛选技术是将多种技术方法有机结合而形成的一种新技术体系，它以微孔板、微流控、芯片形式作为实验工具载体，以自动化操作系统执行实验过程，以灵敏快速的检测仪器采集实验数据，以计算机对数以千计的样品数据进行分析处理，从而得出科学准确的实验结果。结合活性生物活性WesternblotIHCFCMSPR/BLIELISACDC细胞增殖、分泌、迁移中和活性检测酶、激酶活性ADCC&ADCP02义翘神州SPR/BLI技术原理、优势及应用义翘神州技术原理SPR实时传感图SPR原理BLI原理BLI实时传感图ABC义翘神州分析范围SizeMW1000nm200nm75nm7nm1nm0.1nm1,0001,000,000100,0001501细胞细菌病毒免疫球蛋白抗体抗原蛋白质脂质纳米材料糖类肽类核酸小分子化合物细胞-蛋白细菌-蛋白病毒-蛋白抗体-抗原蛋白-蛋白核酸-蛋白蛋白-脂类蛋白-糖类蛋白-肽类蛋白-小分子化合物多分子相互作用蛋白浓度定量SPR检测小分子无分子量下限，灵敏度更高，检测亲和力范围mM~fMBLI分子量检测下限为150Da，检测亲和力范围mM~pM弱结合中等强度强结合mM10-3μM10-6nM10-9•亲和素-生物素结合：10-14M•强的抗原-抗体结合：10-8~10-10M•DNA与蛋白的结合：10-8~10-10M•蛋白与小分子结合：10-3~10-6M亲和力(Affinity,KD)义翘神州互作信息有无结合(YesorNo)结合的特异性和选择性(Specificity)两种分子的结合强度--亲和力(Affinity)结合和解离的快慢--动力学(Kinetics)目标分子活性含量的检测(Concentration)技术优势无需标记灵敏度高

实时监测动力学数据

高通量SPR分析温度为4~40℃，可提供热力学信息BLI分析温度为室温~40℃，不适用于给定相互作用的热力学参数义翘神州固定配体法：将配体直接或间接的固定于芯片/传感器表面。直接偶联（Immobilization）捕获（Capture）分析方法芯片/传感器SPR：CM系列，CM5、CM3、CM7BLI：AR2G传感器芯片/传感器捕获Mab/Fab：

ProA、ProG、ProLAHC、AMC、Fab捕获标签：NTA、anti-his、SA配体共价偶联芯片/传感器表面常用氨基偶联的方法捕获分子共价偶联芯片/传感器表面捕获分子通过亲合作用偶联配体LigandAnalyteLigandAnalyteCapture义翘神州分析流程BaselineLoadingBaselineAssociationDissociationBLI分析流程：SPR分析流程：固定配体样品进样芯片再生数据分析义翘神州样品要求01样品充分水溶，均一、不聚集02纯度（>90%），蛋白浓度>0.2mg/mL明确等电点/分子量信息03抗体亚型及蛋白标签类型04氨基偶联的配体溶液中不能含有Tris、NaN3、甘氨酸等成分SPR分析物样品中不能含有甘油、蔗糖、咪唑等高折光的成分BLI对样品buffer组分兼容性较好，可检测血清、培养液及裂解液等复杂样品SPR流路系统BLI蘸取式义翘神州Biacore8KOctetRH16高通量设备检测通道：16通道KD范围：mM~pM分析温度：室温~40℃分子量检测下限：150Da

样品/试剂载量：2×96或384孔板检测通道：8根进样针，16通道KD范围：mM~fM

分析温度：4~40℃分子量检测下限：无

样品/试剂载量：4×96或384孔板义翘神州SPR/BLI的应用抗体药物Fc受体及C1q结合活性表征国产PD-1单抗NDA申报——信达生物2018年PD-1单抗国内上市，速度非凡2019年唯一进入医保名录的国产PD-1抗体PreclinicalcharacterizationofSintilimab,afullyhumananti-PD-1therapeuticmonoclonalantibodyforcancer.AntibodyTherapeutics.义翘神州SPR/BLI的应用生物反应器中细胞抗体表达量——MedImmuneAmbr15生物反应器罐体2×107cells/mL（左）1×108cells/mL

（右）连续20天Titer监控Enhancingthefunctionalityofamicroscalebioreactorsystemasanindustrialprocessdevelopmenttoolformammalianperfusionculture.BiotechnologyandBioengineering.药物活性浓度定量筛选义翘神州SPR/BLI的应用基于Biacore垂钓实验来筛选中药活性成分——第二军医大学联合上海大学AstrategyofscreeningandbindinganalysisofbioactivecomponentsfromtraditionalChinesemedicinebasedonsurfaceplasmonresonancebiosensor.PharmaceuticalAnalysisFig.3.AffinitiesofthebioactivecandidatestowardsTNF-R1determinedbysurfaceplasmonresonance(SPR)affinityassay.(A)Sensorgramsofserialconcentrationsofpaeoniflorin(0-33.3μM).(B)Affinityconstantofpaeoniflorin.(C)Sensorgramsofserialconcentrationsofpaeonol(0-33.3μM).(D)Affinityconstantofpaeonol.分子垂钓--新靶点发现义翘神州SPR/BLI的应用batchka(1/Ms)kd(1/s)KD(M)12.95E+059.23E-053.13E-1023.09E+058.46E-052.74E-1033.11E+058.29E-052.67E-1043.04E+058.55E-052.81E-1053.06E+058.75E-052.86E-1063.13E+058.26E-052.64E-10Average3.06E+058.59E-052.81E-10STDEV6.33E+033.63E-061.78E-11CV（%）2.07%4.22%6.33%6批次药物与PCSK9蛋白亲和力质控放行药物生产、质控与批次放行Time(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)ResponseTime(s)Response03义翘神州高通量SPR/BLI应用案例分享义翘神州项目背景：针对蛋白靶点，AI设计抗体序列并重组表达，筛选阳性且亲和力高的抗体案例分享1：高通量SPR在AI设计重组抗体的筛选中的应用筛选策略：亲和力KD检测二抗抗原重组抗体ELISA上清bindingSPR上清rankingproteinA芯片重组抗体重组抗体：200重组抗体：56阳性上清表达纯化抗原义翘神州上清SPRranking结果上清SPR亲和力排序结果纯化抗体SPR亲和力筛选结果KD=1.9E-09KD=1.59E-09mAb-34mAb-51案例分享1：高通量SPR在AI设计重组抗体的筛选中的应用Time(s)ResponseTime(s)Response义翘神州案例分享2：高通量SPR在抗体表位分析中的应用抗原第一抗体第二抗体表位分析方法：项目背景：针对7株鼠单抗进行表位分析常用且节省抗原的方法：TandemAssayTandemAssaySandwichAssayPremixAssay抗原第一抗体第二抗体抗原第二抗体抗原第一抗体第二抗体义翘神州案例分享2：高通量SPR在抗体表位分析中的应用TheheatmapTandemAssay结果解析：两株抗体是竞争关系两株抗体是非竞争关系抗体自我竞争两株抗体正向与反向竞争不一致，此方向为竞争两株抗体正向与反向竞争不一致，此方向为非竞争Thebinchartbin1bin2bin3bin3中的3株抗体与bin2中的抗体2单向竞争带箭头的线：表示抗体2作为第一抗体，与箭头指向方向的抗体作为第二抗体单向竞争bin1中的7株抗体与bin2中的抗体2相互竞争不带箭头的线：双向相互竞争义翘神州案例分享2：高通量SPR在抗体表位分析中的应用mAb7mAb6mAb5mAb4mAb3mAb2mAb1mAb1为单独表位，与其他抗体无竞争关系

其余6株抗体为完全竞争关系，抗体表位相同7株抗体表位检测结果：抑制率mAb1mAb2mAb3mAb4mAb5mAb6mAb7mAb15.5%83.7%83.7%85.1%62.9%77.6%97.3%mAb296.6%5.1%10.4%5.5%5.2%19.1%16.6%mAb393.6%11.4%11.5%16.8%15.9%4.9%15.2%mAb4108.4%12.9%17.7%15.3%16.2%15.7%7.5%mAb5117.7%11.9%16.9%17.1%6.1%15.6%10.8%mAb690.3%13.9%15.7%19.4%12.3%10.2%18.1%mAb7104.1%11.1%13.2%13.4%13.4%13.8%12.4%抑制率20%-60%，部分竞争抑制率<20%，完全竞争，如果有一个方向达到这个标准，则认为两个抗体有竞争抑制率>60%，完全不竞争义翘神州案例分享3：高通量BLI在纳米抗体（VHH）亲和力成熟中的应用筛选策略：目标：亲和力提升至少5倍野生型抗体：纳米抗体VHH-Fc项目背景：强阳性上清亲和力KD检测二抗抗原VHFc纳米抗体VHH-Fc上清ELISA上清bindingBLI上清rankingVHFcAgProteinAsensorAg表达纯化义翘神州Kakd(1/s)上清筛选结果纯化抗体鉴定亲和力提高一个数量级案例分享3：高通量BLI在纳米抗体（VHH）亲和力成熟中的应用Response(nm)Time(sec)野生型VHHResponse(nm)Time(sec)KD=1.18E-08MmAb-63Response(nm)Time(sec)KD=1.22E-09M义翘神州案例分享4：高通量BLI在抗体表位分析中的应用项目背景：针对23株鼠单抗进行表位分析注：1.需要样品量较大，因为要用到饱和浓度。2.尽量选择固化高度（饱和信号）相近的抗体比较。

先检测1（ligand）与2和3（analyte）间单独的相互作用2需要与1结合比较强2样品需要饱和

比较3在有无2的情况下的信号表位分析方法义翘神州

MAb16MAb6MAb19MAb22MAb17MAb9MAb15MAb5MAb1MAb3MAb18MAb10MAb21MAb20MAb7MAb4MAb12MAb13MAb8MAb14MAb2MAb11MAb23MAb16-2.0%2.8%2.8%2.0%82.2%78.1%97.0%102.2%82.1%92.6%104.4%116.2%101.5%178.6%113.9%113.4%127.1%84.9%91.6%92.8%89.0%86.9%MAb66.9%-5.6%3.3%-3.2%87.5%85.6%98.3%102.4%96.4%99.8%108.1%125.6%103.4%185.7%114.2%109.7%128.1%87.1%94.6%94.7%92.7%78.6%MAb195.7%2.4%-4.6%2.6%70.7%73.9%94.9%102.7%81.8%94.0%97.1%117.3%103.0%172.6%111.0%108.9%122.1%2.4%92.7%90.6%94.2%86.9%MAb224.0%1.6%1.1%--3.7%83.5%81.9%102.8%100.6%93.3%98.5%106.4%106.6%96.0%182.5%111.7%109.3%125.5%91.7%92.7%93.3%88.5%87.4%MAb173.3%0.3%4.2%3.7%-91.6%103.8%106.4%109.7%98.1%107.5%106.3%126.4%114.2%207.8%124.2%118.8%127.0%103.5%98.3%103.5%96.3%101.0%MAb992.5%86.1%78.5%88.7%79.6%-12.9%18.2%25.3%16.8%14.7%2.7%27.3%78.4%115.3%116.0%114.4%131.6%105.3%105.0%104.0%101.1%80.9%MAb1581.6%79.2%73.9%79.3%76.7%9.7%-12.3%10.6%9.3%9.3%13.8%17.8%83.3%115.8%120.4%114.9%135.1%87.3%100.4%93.5%96.1%76.2%MAb580.1%73.1%71.0%86.4%64.3%3.4%1.6%-4.1%0.1%3.2%1.9%5.8%3.5%92.0%100.8%106.2%103.4%81.5%86.3%84.9%70.6%66.1%MAb168.8%60.7%70.6%86.1%55.8%3.5%-0.04%2.6%--0.4%-0.2%-0.8%7.6%3.1%84.2%93.9%84.1%103.0%71.6%69.9%79.5%67.8%62.8%MAb373.7%67.2%72.1%83.8%62.8%8.7%-0.5%0.3%5.9%-5.8%9.4%11.3%7.0%88.3%99.2%98.3%106.4%75.0%80.6%83.5%78.9%63.9%MAb1869.2%70.1%69.7%84.7%67.0%5.1%0.5%2.1%3.1%1.1%-3.7%7.4%5.3%92.0%99.6%90.8%104.2%80.5%78.3%81.9%79.8%78.4%MAb1073.4%67.9%70.5%82.2%64.1%6.2%2.6%2.7%1.7%2.6%-0.4%-6.7%2.4%80.9%88.7%92.1%104.6%70.9%74.6%75.4%75.2%56.8%MAb2152.1%51.9%59.8%61.0%53.9%1.0%-0.8%-2.5%-1.1%-2.3%-0.1%-0.9%-6.1%67.6%78.8%78.7%93.4%60.1%61.5%60.2%61.6%62.5%MAb2073.1%66.1%71.4%74.0%64.3%41.8%47.5%-0.5%-1.1%-1.5%0.3%-0.3%3.4%-92.0%94.5%95.6%111.2%79.9%81.0%77.0%85.0%80.5%MAb730.0%31.0%33.2%39.6%29.3%2.9%1.2%2.2%2.3%2.1%4.2%1.6%5.5%4.2%-44.3%43.1%44.2%1.6%2.6%3.1%1.9%3.5%MAb464.6%68.5%67.2%70.0%62.6%69.6%73.8%78.9%80.0%72.7%71.6%84.8%97.4%83.1%147.8%-10.0%7.6%75.8%75.5%76.6%65.9%55.0%MAb1264.6%64.1%60.7%65.2%56.9%56.9%58.6%73.2%78.6%67.6%71.4%82.0%96.2%76.9%129.9%6.1%-12.6%82.0%69.9%71.1%71.0%53.3%MAb1363.7%59.1%62.1%64.8%59.9%53.5%56.0%65.3%69.8%62.8%70.0%73.8%90.1%77.2%118.8%10.6%8.8%-73.8%63.7%64.6%61.3%49.2%MAb878.4%72.1%72.0%79.1%59.4%75.9%75.6%79.9%86.1%75.2%79.7%91.8%107.1%96.2%89.3%102.2%101.0%110.0%-3.9%5.3%0.5%3.0%MAb1462.7%61.7%75.8%80.9%71.4%66.9%64.0%72.1%79.0%68.7%82.8%83.3%103.1%100.9%77.0%96.7%90.1%100.9%-