受体的放射分析-核医学与核药学教学、学习课件

第七章受体的放射分析

§1.概论

受体:细胞表面或亚细胞组分中的一种分子，可以识别并特异地与有生物活性的化学信号物质（配基）结合，从而激活或启动一系列生化反应，最后导致该信号物质特定的生物效应。迄今为止，所有已发现的受体都是具有特定氨基酸序列和特定构型的蛋白质。每一种受体在细胞上都有特定的宏观分布和微观分布。

一、受体功能（1）识别特异的信号物质--配基，识别的表现在于两者的特异结合。（2）把识别和接受的信号准确无误的放大并传递到细胞内部，同时启动一系列胞内生化反应，最后导致特定的细胞反应，使得胞间信号转换为胞内信号。二、受体的分类:

1、膜受体跨膜2、核受体细胞内

受体的亚型：指受体分子结构上既有部分相同之处，也存在部分差别，它们对一定的配基有不同的亲和力，在生物学上具有各自不同的效应。受体亚型的区分是生物进化的结果，有利于机体处理信息的能力及适应性更强。受体数量：占细胞蛋白总量十万之一到百万分之一（一个细胞上仅有数千个受体分子），一般方法难以分离和测定受体分子。

配体：是指能和受体结合并引起相关效应的化合物。除了与受体结合外本身并无其他功能，它不能参加代谢产生有用产物，也不直接诱导任何细胞活性，更无酶的特点，它唯一的功能就是通知细胞在环境中存在一种特殊信号或刺激因素。

配体与受体的结合是一种分子识别过程，它靠氢键、离子键与范德华力的作用，随着两种分子空间结构互补程度增加，相互作用基团之间距离就会缩短，作用力就会大大增加，因此分子空间结构的互补性是特异结合的主要因素。同一配体可能有两种或两种以上的不同受体，例如乙酰胆碱有烟碱型和毒蕈型两种受体，同一配体与不同类型受体结合会产生不同的细胞反应。如Ach可以使骨骼肌兴奋，但对心肌则是抑制的。配基可以是神经递质、激素、某些药物等。三、跨膜受体的信号传递通路

跨膜受体是含糖或不含糖的蛋白质分子，它的主要作用是将细胞外的信号传导到细胞内，信号再从细胞浆传递到效应器，最后是一个特定的生物学效应。信号的这种传导过程称为信号传导通路（signaltransudationpathway），它是当今生物学领域中一个重大的研究课题。四、受体与配基结合的特性

1、可饱和性（satiability）：受体结合反应呈高亲和性和低容量，而非特异结合则呈低亲和性和高容量，后者的剂量反应曲线不呈可饱和性。2、可逆性（reversibility）：激素、递质和药物与特异性受体结合反应是可逆的，当受体周围的配基浓度降低，结合反应就逆向进行，即配基受体复合物很快解离，解离后的配基是原形，不起代谢变化，这跟酶与底物作用结果不同，底物经酶作用后变成代谢产物。4、与效应的一致性

受体的主要功能是介导配基的生物效应，如果一种蛋白能与某种物质结合而不介导特定的生物效应，那么这种蛋白不能称之为受体。所以用生物效应作为观察受体和配基性质的标准是十分必要的。从配基的角度分析，有的是阳性效应，有的是阴性效应。阳性效应就是配基与受体结合后引起阳性生理效应，称为激动剂。阴性效应就是配基与受体结合后不但不引起阳性生理效应，而且阻断内源性配基的阳性生理作用，称为拮抗剂或阻断剂。

五、受体的生理调节

正常生理状态下的受体处在一个不断合成与降解的动态平衡中，但其数量和亲和性也会因疾病、药物作用而发生变化。1、向下调节（down-regulation）

细胞所处环境中某种激动剂的浓度增高或长期作用，其结果使相应受体的数量减少，并出现受体对此物质的敏感性下降，或耐受性增高等现象，如哮喘病人长期服用β-激动剂产生的耐受性增高，即药效减弱。

六、受体与疾病遗传缺陷与免疫异常为受体性疾病的常见原因1、基因突变致使受体异常，引发功能障碍，绝大多数是功能降低或完全丧失，有家族史，病情严重。如睾酮受体基因突变致该受体缺陷引起睾丸完全雌性化病。2、机体对受体产生自身抗体，激动（如Graves`综合症患者产生TSH受体抗体，直接持续激动甲状腺TSH受体）或阻断（如重症肌无力患者产生N-Ach受体抗体，占领但不记得受体）受体。3、某些病有受体异常，非原始发病环节，为发病重要环节，采取针对措施可控制病情。甲亢用β肾上腺素阻断剂，哮喘用β肾上腺素激动剂。4、受体与肿瘤：激素受体在肿瘤中存在与否决定治疗方案（乳腺癌白血病）；某些受体基因可突变成为癌基因，引发肿瘤。§2.受体配基结合反应的基本原理

RBA的基本原理与IRMA基本相同，应用放射性标记配体，在一定条件下与受体（R）结合成配体与受体复合物（R－*L），分离并测定R－*L的放射性，然后经数据处理，可测得受体的亲和力和受体的数量。一、受体与配基相互结合的基本规律（一）质量作用定律（massactionlaw）

简单单位点系统：指对某种受体而言，它的全部受体都以相同的亲和性以单分子与特定的配基相结合，而且不表现明显的正负协同作用，理论上讲结合后产生的生物效应也应完全相同。这种系统称之为。。有时，一个受体系统中存在两（多）种亚型，但所用配基无选择性，尽管亚型的生物效应可能不全相同，结合反应却表现出完全相同的特征，这时，也可作为单位点系统来看待。（二）复合物的浓度和配基浓度的关系：

可以看出，[RL]和[LT]并非线性关系，而是曲线关系，对一定数量（[RT]固定）和一定亲和力（KD固定）的受体来说，配基浓度从零开始上升时，复合物浓度先是上升很快，以后逐渐变慢，最后绝大多数受体都变为复合物，也就是受体被饱和了。这就是饱和曲线（saturationcurve)（图9－1）。

曲线的高度主要反映受体的数量多少，曲线上升的快慢则主要反映受体和配基的亲和力。

（三）非特异结合（non-specificbinding，NSB）

上述饱和曲线是受体与配基的特异结合形成的。这种结合的特点是低容量和高亲和力，所以容易饱和。但是，任何受体标本除特异结合外，还会有一部分非特异结合，当分离特异结合的复合物测量放射性时，这部分非特异结合的放射性混在一起，测到的是总放射性（totalbinding，TB），必需先减去非特异结合（NSB），才能得到特异结合（specificbinding，SB）的放射性。

NSB主要来自杂蛋白，反应器壁，分离材料的吸附，它的特点是，容量很大，而亲和力低，因此在一般情况下不被饱和，也就是随着配基浓度的升高，它不呈饱和曲线，而是一条上升的直线（图9－l）。另外，如果系统中存在大量同种受体的非标记配基，则放射性的SB被非标记配基取代，而NSB由于容量很大，空余的位点很多，放射性不被取代。所以要从TB中减去NSB，最基本的办法是做一系列平行管，所有的条件都与TB管相同，只是多加100－1000倍量的非标记配基，将SB完全取代掉，这时的放射性结合即为NSB。由于NSB和放射配基呈直线关系，多点饱和法的实验中往往只需做3－4点，再用直线回归法求出其余各点的放射性。

（四）正负协同作用

当一部分受体与配基结合后使相邻的受体的亲和力发生改变，倘若亲和力逐步下降，称之为负协同作用如曲线（2），亲和力逐步增大，称之为正协同作用如曲线（3）。

（五）受体与配基反应的动力学（kinetics）

受体与配基的结合反应一般都较快（多数在数十秒至数十分钟）达到平衡。当周围的游离配基急剧下降，或非标记配基浓度急剧升高时，放射性复合物的解离也很快，这种快速结合和快速解离对保证受体的迅速反应有很重要的意义。（六）竞争性取代反应

在一个受体和放射配基的反应系统中加入另一个化合物，它若能和受体的结合位点结合，则会与放射配基竞争与受体结合，最终将表现为放射配基与受体形成复合物的能力降低，但受体数量不变,所以叫竞争性取代反应。此时，非标记的起竞争作用的配基称为竞争剂,它们和受体结合后不改变受体分子的结构。

表示竞争剂抑制作用强弱的指标有二个：IC50值和KI。IC50值是指抑制50％受体与放射配基结合所需竞争剂的浓度，IC50值大，表明竞争剂抑制作用小。KI则是指竞争剂的平衡解离常数，KI越小，表明竞争剂抑制作用越大。

二、双（多）位点系统

一种配基可以和两种以上的受体亚型结合，每种亚型都有相应的KD值（自学）。§3.受体放射分析的基本方法

离体RBA基本方法的流程为：

一、放射性配基的要求

制备优良的放射性配基是受体结合试验的首要条件。对任何一种受体系统，通常都有好几种标记配基可供选择。选择应从两方面考虑：①配基的特性；②实验目的。

（一）对放射性配基的基本要求1、高比活度：组织细胞内的受体浓度一般都很低，约104-105个/细胞，或0.01-3.0pmol/mg蛋白的水平，低比活度的配基难于达到分析灵敏度的要求。

一般要求配基比活度至少在3.7×1011Bq（10Ci）／mmol以上。另外，配基比活度高，加入反应管的放射性配基量才有可能减少，从而有利于用小量标本得到可靠的数据，并有利降低非特异性结合率。2、高亲和力:亲和力高，可以减少标记配基用量，从而既可降低非特异性结合，又可使放射性配基与受体的结合物解离变慢，便于进行结合和游离配基的分离。不仅方便操作，而且获得的数据准确。

3、特异性强:即该配基与所研究受体有选择性结合，理想的是该配基只与一种受体或受体亚型结合。但没有一种配基是完全选择性的，所以要结合实验研究的目的，选择对某一受体或其中某一亚型亲和力高的放射性配基。4、高的稳定性及放化纯度:包括标记的稳定性、贮藏时的稳定性以及温育分析时之稳定性,同时具有95%以上的放化纯度。

总的来说,配基的选择要根据实验目来定。

目前，用作受体放射分析的放射性配基多用3H、125I标记。3H标记配基与原型配基为同型式，生物学活性好，多数情况下比活度也能达到要求，且半衰期长，使用方便，主要缺点是需用液闪测量，操作较麻烦，一般实验室不能进行标记。多肽及蛋白质配基多用125I标记，其优点是可以达到较高的比活度。只要很好掌握标记条件，仍能保持较好的生物活性。另外，碘标记法快速、方便、经济，一般实验室可进行。（二）放射性配基的质量鉴定1、放射化学纯度:除新鲜产品外,存放一定时间后的标记配基均应重测其放化纯度，以保证分析的准确性。一般要求放化纯度应在95％以上。2、结合活性鉴定

3、比活度：受体结合分析的结果计算离不开准确的比活度数据。二、受体标本的制备

在受体结合实验的研究中，所用的受体材料可以是组织切片，也可以是完整的单层培养细胞或游离活细胞，粗制的或纯化的细胞膜受体，可溶性的受体蛋白等。

（一）组织切片

冷冻组织切片常用明胶粘贴于玻片上，在温育缓冲液中与标记配基进行反应。反应后用缓冲液洗几次即可，切片厚度一般为5-50μm。用组织切片的目的更多是研究受体的分布（用放射自显影法或免疫组化）。

（二）游离的完整细胞悬液

完整的活细胞可以是血细胞，培养的单层细胞，肿瘤的腹水型细胞以及经处理的原代细胞等，使用完整细胞的优点：1、受体处于原有的正常环境中。膜未受扰乱，膜内pH、离子梯度也保存着。受体与其相连的效应系统（如G蛋白）也保存完好。2、在受体功能反应完全的情况下研究受体，可以同时观察配基与受体结合的情况和细胞的生物效应。所得的结果更能反映受体的生理特点。3、能直接给出平均每一个细胞的受体数。

但完整细胞的受体分析较难控制分析条件。操作过程可能导致细胞表面生理活性的改变，因此结果有时不够稳定。另外，若细胞上某种受体的含量低，作分析时需加入大量细胞才能获得足够的放射性计数，给实际工作带来一定困难。完整细胞来源分三种：①从组织分离出游离细胞；②血细胞；③培养细胞。一般都需采用台盼蓝等检查细胞活性。

（三）膜制剂（membranouspreparation）

绝大多数受体结合分析使用膜制剂。使用膜制剂可以减少非特异性结合率。而且，在膜制备过程中，通过洗膜的方法，可以将内源性配基洗去，并除去部分蛋白溶解酶。膜制剂通常也保存有受体-效应器结合系统。但受体功能的其他方面则失去了。另外，膜内离子浓度梯度、受体与细胞结构关系也失去了。但是，受体结合需要的是膜双层脂质结构本身，而不是细胞内其他组份。所以膜碎片内仍保留受体的药理学特性。

细胞膜和细胞浆受体的制备一般都利用蔗糖密度（0.25～0.3mol／L）梯度离心法分离不同的亚细胞组分。其优点是除去大部分杂蛋白，以减小非特异结合。为保证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意：①全部过程在0℃-4℃下进行操作。②制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它物质（如EDTA，Mg2＋）应严格控制。③组织匀浆条件应保持一致。④离心的时间、速度、温度应保持恒定。⑤为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。

细胞组份的分离一般采用差速离心法。通过适当控制离心力及离心时间可使某些颗粒组份沉淀，而另一些保留在上清液中。细胞组份的一般分离流程如下：

三、结合反应的类型

（一）标记配基饱和法1、单点饱和法：定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体-配基复合物的放射性计算受体结合容量（或结合位点数）。这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出KD，误差也相对大些。

2、多点饱和法：一定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量（一般7-8个实验点），使受体的结合趋于饱和。用曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力（RT、KD），结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大，工作量大。

（二）非标记配基饱和法

一定量的受体制剂和标记配基，逐渐增加非标记配基（一般7－8个实验点），使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。

四、分析条件的选择

（一）标记配基浓度（二）受体浓度（三）温育温度与时间（四）缓冲液

五、结合与游离配基的分离

受体-配基结合分析主要是测定反应平衡时结合配基的量，求解受体的密度与平衡解离常数。反应一般在达到平衡后先经分离，再测结合部分的放射性。理论