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DB33-PCR检测方法Real-timePCRdetectiontechniqueforJapaneseencephal浙江省市场监督管理局发布I1猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT－PCR检测方法本标准规定了猪流行性乙型脑炎病毒（Japaneseencephalitisvirus，JEV）荧光定量RT－PCR检除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试3.2.1Trizol：核糖核酸（Ribonucleicacid,RNA2）：KCl0.2g,KH2PO40.2g,NaCl3.2.8引物和探针，其序列如下：上游引物：5－GGCTCTTATCACGTTCTTCAAGTTT-3，下游引物：5-TGCTTTCCATCGGCCYAAAA-3，探针：5－FAM-AGCATTAGCCCCGACCAAGGCG-TAMRA-4.1样品采集4.1.1脑组织：选择代表性病症的病死猪，应无菌采集脑组织，将采集到的脑组若不能及时送检的全血，应分离血清置于-20℃以下保4.2样品处理4.2.2取全血3500r/min离心54.3.2取n个灭菌的1.5mL离心管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，对每个离4.3.3每管加入750μLTrizol，分别加入被检样品中离心后的上清液（注意不吸出中间层）转移至相应的管中，加入等体积异丙醇，混4.4.1反应体系组成设立阳性对照、阴性对照，反应体系（20µL）由表用量/µLPrimeScriptRTEnzyme444.4.2反应条件4.4.3荧光素的设定ReportDye设定为FAM，QuencherDye设定为5.1结果分析条件设定5.2质控标准阳性对照的Ct值应≤30并出现典型的扩增曲线，阴性5.3结果描述及判定Ct值≤35，且出现典型扩增
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