PCR基础知识资料

PCR实验操作程序

1.在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：

反应物加样顺序体积（口1）终浓度

去离子水129.4

10XBufferB25IX

4XdNTP混合物35各200umol/L

MgCL431.5mmol/L

有义引物52.60.25ymol/L

反义引物62.60.25umol/L

模板720.1ug

TaqDNA聚合酶80.4lunit

2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50ul矿物油。每加一管换一次Tip。

3.振荡每只管，然后短暂离心。

4.将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：

预变性94℃4分钟1次

变性94-C1分钟

退火37-65c1分钟

延伸72,C1分钟

循环30次

终延伸72℃7分钟1次

保存4c

5.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，分析结果。电泳条件：60-80VJ5-20分钟。

6.紫外分析仪检查电泳结果。

四、讨论

1.假阴性，不出现扩增条带

PCR反应的关键环节有①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量，④PCR循环条件。寻

找原因亦应针对上述环节进行分析研究。

模板：①模板中含有Taq酶抑制剂，②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。③模板核酸变性不彻

底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA

模板配合检查模板质量。

酶失活：需更换新葡，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。

引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散

的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称

扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看0D值，更要注重引物原液做琼脂糖

凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条

带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物

时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失

效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。

Mg2♦浓度：随2.离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影

响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

反应体积的改变：通常进行PCR犷增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或lOOul,应用多大体积进行

PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条

件，否则容易失败。

物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温

度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增

效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR

失败的原因之一。

靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板

失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。

2.假阳性

出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。

引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的

PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。

靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染,导致假阳性。

这种假阳性可用以下方法解决：①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。②除

酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。③

必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，

这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假

阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。

3.出现非特异性扩增带

PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg"离子浓

度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异

条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：①必要时重新设计引物。

②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度

或采用二温度点法（93*C变性，66P左右退火与延伸）。

4.出现片状拖带或涂抹带

PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或函的质量差，dNTP浓度过

高，Mg,‘浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②

减少dNTP的浓度。③适当降低Mg?.浓度。④增加模板量，减少循环次数。

测序常见问题及其分析

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1・1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序

结果移码）

图1・1

aCC；TGT.COTOCOCTTCNTTTTNGGNGGCCCTTOGGC

wwv.bbioo.con)

CAC-.TGCGTCGCG:GNCC:<^TTCGG7GGTG：-TTOTGCNXACGGGTGNT'-CVGTGGGC/XTCTGCCCTTC.CTC

333.bbioo.Gom

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T教体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE

纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产

物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

CTTANXCC；TNTMf.CTCN1TTNGCTTC-CCOTTGNGHKCMTCCCCNTTTCWTMTGQCWTCT

333.bbioo.con)

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱

基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表

面在图形上便是一开始就是严重的峰形重登。

解决方法：重新合成引物，或将引物进行PAGE纯化

2、克隆测序时出现峰形重叠

ATCTGTTTTTTTTOTTGTGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTMCCCNNNCCN1NNTTMMTTT

RACE测序时经常遇到图4-1和图4-4的情形，解决方法：从另一端测序：但如果这样的序列出现在中

间，呵呵，目前还没有很好的解决方法，要看测序公司的本事了。

C/Gcluster在PrV基因组测序时遇到过。后来还是让TaKaRa公司给解决了，虽然不喜欢鬼子，但有

时候却不得不用它们的产品和服务。

5、基因中含有重复序列

cccii:cc?ccciMCCc:'CCCT'»cccr*'CC€tcccrT»cccr>•ccc!'*ccc?Hfl-:i?JCCc:cccrAiccmccwccrc

www.bbioQ.com

可能的原因：样品中含有重便序列导致的测序结果和PolyA/T的结果一样，会导致Frame滑动，较短的

重徨序列会导致测序结果出现移码：而较长的重便序列会使定序信号衰减。

解决办法：反向测序有时能够顺利的通过重便序列区域（但不是一定都能够），通过多次的测序结果比对，

拼接可以得到全序列结果。

PCR常见问题的精辟总结-耶鲁大学

QUESTIONSSOLUTIONS

1.1get(many)longerunspecificDecreaM!aniKalingtime

products.WhalcanIdo?IncrcaM：annculingicmpcHUure

Decreaseextensiontime

Decreaseextensiontemperatureto62-68°C

IncreaseKCI(buflcr)concentrationto1,2x-2x.butkeepMgCI2concentrationat

liKrcascMgCI2coiKcntrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentration

constant.

Takelessprimer

TakelessDNAtemplate

TakelessTagpolymerase

Ifnoneof(heaboveworks:checktheprimerforrepdilivcsequences(BLAST

alignthesequencewiththedatabas^^)andchangeibeprimers)

Combinesome/alloftheabove

2.1get(many)shorterunspecificIncreaseannealingicmpcrMurc

products.WhatcanIdo?IncnsiM:annculinglime

Increaseextensiontime

Incf^a^eextension(en)peraiureto74-78°C

DecreaseKC1(buflfcr)concentrationtoO.7-O.8x.butkeepMgC12concentrationat

152mM

IncreaseMgCI2concoKrationupto3-4.5mMbulkeepdNTPconcentration

constani

Takelessprimer

TakelessDNAtemplate

TakeTaqpolymerase

Ifnoneof(heaboveworks:checktheprimerforrepetitivesequences(BLAST

alignthe阴uencewithibedatabases)3ndchangeibeprimerf^)

Combinesome/alloftheabove

3.Reactionwasworkingbefore,butnowMakesureallPCRingredknuaretakeninIbereaction(buffer,(emphie.Taq,etc)

Ican'<getanyproduct.ChangethedNTPsolution(verysensitivetocyclesofthawingandfreezing.

especiallyinmultiplexPCR)

Ifyoujustboughtnewprimers,checkfbr(heirrdiabiliiy(badprimersynthesis?)

primeranu)uni

Increase(emphteanKxml

Decreaseannealingicmpcraturcby6-IO^Candcheckifyougeta)yproduct.If

youdon't,checkallyourPCRingredienis.Ifyxxi<k)gelproducts(including

unspecificones)reactionconditionsasdescribedabove.

Combinesome/alloftbeabove

4.MyPCRproductisweak.IsthereaGraduallydecreasetheannealingtemperaturetothelowestpossible.

waytotheyield?(heanu)un<ofPCRprinter

Increase<hcamountofDNAtemplate

Increase(heamountofTaqpolymcras>c

Changebutter(KCI)oonccnlrudon(higherifproductixlowerthanlOOObpor

lowerifproductishigherchanlOOObp)

Addadjuvants.Best,useBSA(0.1io0.8pg.'pl.finalconcenlralkn).Youcanalno

try5%(v/v.Gnalconcentration)DMSOorglycerol.

Checkprimersequencesfbrmumaiche^and/orincreasetheprinwrlengthby5

nucleotides

Combineoftheabove

5.MytwoprimershaveverydiffcrcniAneasysolutionistoincreasethelengthoftheprimerwithlowIm.Ifyouneed(o

meltingteinperaiures(Tm)but1cannoikeepthesizeoftheproductconsunuaddafewba&esatthe3'end.Ifsizeisnoia

change(heirlocus.Whatcan1dotoconcern,addafewbasesateitherthe3'orthe5'endof(hatprim，.

improvePCRampliGcaiion?

6.1haveanumberofprimerpairsIVerylikely,yes.

wouldliketousetogether.Can1runaTryamplifyalllociseapracelyusingthesamePCRprogram.Ifoneoftheprimer

multiplexPCRwiththem?.Hou,?pairsyieldsunspecificproducts,keepthecyclingconditionsconstmtandchange

ocherparaineiers的mentionedabove(种1and#2%

Mixequimolaramountsofprimersandrunthemultiplexreactioneitherinthe

samecyclingconditionsorbydecreasingonlyiheamuraJingccmpeniturcby4°C.

Ifsomeof(belocian:weakornotamplified,n»dbelow!?

7.Howmanylocican1amplifyinDifficulttosay.Theauthorhasroutinelyamplifiedfrom2to14loci.

multiplexPCRatthesametime?Literaturedescribesupto25lociorso.

8.OneorafewlociinmymultiplexThefirstchoiceshouldbeincreasingibeamouniofprimerforthe•weak"locial

reactionarcveryweakorinvisible.Hovthesametimewithdecreasing(beamountofprimerforalllocithatcanbe

canamplifytltem?amplified.Thebalancebetweenthe&eamountsismoreimpoftanihanibeab&oluce

valuesused!!.

Cheekprimersequencesforprimcr-primcrinteractions

9.ShortPCRproductsinmymultiplexIncreaseKCI(bciflcr)conccntraiiontol.2x-2x.butkeepMgCI2concentrationat

reactionareweak.HowcanIimprovel3-2inM

(heiryield?DecrCiiM?denaturingtime

Decreaseannealingtimeandtemporalurc

Decreaseextensionlimeand(emperaturv

Incnc:ascamountofprimersfortheWwcak"lociwhiledecreasingticamountforthe

estrong'*loci.

Addadjuvants.Best,useBSA(0.1(o0.8pg/pLfinalconcoitraticn).Youoinalso

try5%(v/v.finalconcentration)DMSOorglycerol

Combine$omc/ulloftheabove

10.LongerPCRproductsinmyDeeres犍KC1(bufYer)conc€nirationio0.7-0.8x,butkeepMgCI2coiKenirationat

multiplexreactionarcweak.HowcanI1.5-2mM

improve(heiryield?Incn»seMgCI2concenirationupto3-4.5mMbutkeepdbJTPcoiicencration

conMant.

Increasedenaturingtime

IncnsiM：annealinglime

Decreaseannealingtemperature

Incmweexteiuion(iineandteinperaiure

Increaseamountofprimersforthe"weak"lociwhiledecreasinglieamountforthe

^rong"loci

Addadjuvants.B^suuseBSA(0.1to0.8pg.>pLfinalconcentraiicn).Youcanalso

tryyVtt(v/v,finalcooccntruoon)1>M5Uorglycerol

Combinesomc/alloftheabove

11.AilproductsinmymultiplexncactkoDccrcascannealinglimeinsmallsteps(2*C)

areweak.HowcanIimproveyield?Deceaseextennionteinperaiureio62-68°C

Increaseextension(imc

Increase(eniphtccoiKCiKration

IncreaseoverallprimercoiKcn(nition

AdjustTaqpolymeraseconcentration

ChangeKCI(bufYer)conceniraiion,butkeepMgCI2concentratiOBatl.5-2mM

IncreaseMgCI2coiKcntrationupto3-4.5mMbutkeepdNTPconcentration

conMani.

Addadjuvants.Best,useBSA(0.1(o0.8pg/pLfinalcofKcn(raticn).Youcanalso

try5%(v/v.Gnaiconceninuion)DMSOorglycerol

Combinesome/alloftheabove

12.UnspecificproductsappearinmyIflong:inct^suebuffercotKentraiioniol.2-2x.butkeepMgCI2a)i)cen(ruiion2H

multiplexreaction.CanIgetridofthem1.5-2mM

somehow?Ifshort:decre^ebufferconcetKrationco0.7-0.9x.bmkeepMgCI2conceniraiion

atl,5-2<nM

Graduallyincrease(heannealingtemperature

Decrease“mournof(cmplaic

Decreaseamountofprimer

Decreaseamountofenzyme

IncreaseMgCI2concoKrationupto3-4.5mMbulkeepdNTPconcentration

constant

AddudjuvanKBcM,useBSA(0.1lo0.8pg/pLfinalconceniralicn).Youcunalso

try5%(v/v.finaloonccntraiion)DMSOorglycerol

Ifnothingworks:mnPCRreactionsforeach(multiplexed)locu%individually,

usinganannealingtemperaturelowerthanusual.Comparetheunspecificpcoduds

foreachlocustestedwiththeunspecificproducts犍enwhenrunnngihemultiplex

PCR.Thismayindicatewhichprimerpairyieldstheunspccifkproductsinthe

multiplexreaction.

CombineM>mc/alloftheabove

(Note:primer-primerinteractionsinmultiplexPCRarcusuallytrmslatcdintolack

ofamplificatkxiprixiitcuratherthan(heappearancenfunxptxiGcpnxlucts)

克隆PCR产物问题与解答

1)克随PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：教体比需实验确定。1：1(插入片段：载体)常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。

应测定比值范围。连接用5UI2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连凌酶，插入片段共10叽

室温保温1小时，或40c过夜。在这2种温度下，缺T•凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小

时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需40c过夜。

2）PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。

少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此

需在克隆前做凝胶纯化。

3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨节失效，或污染上带有氨节抗型的质粒，或产生氨不抗型的菌落。

B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100W感受态细胞转化。用SOC稀释到10005后，用100W

铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ngDNA,用SOC稀释到1000u

后含10ngDNA,用1/10铺板，共用1ngDNA。转化率为：

1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（G次方）cfu/ug

转化pGEM-T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生＞20・40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细

胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4DNA连接酶（M1801,M1804,M1794）质量标

准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4DNA连接酶替换。

D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,

按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生＞2040蓝斑，没有菌落或少有菌落,

连接有问题。

4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需40c过夜。

B）插入片段带有污染，使3,-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM・T正对照混合，

再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核

酸酶，使pGEM-T或pGEMTEasy载体35缺失。

C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嗑

咤二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM-TEasy载体克隆

所需。加TaqDNA聚合酶和核昔酸可在末端加A。详情查pGEM-TpGEM-TEasy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，

需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR假阴性问题总结

PCR的假阳性问题深受重视，但我个人认为PCR假阴性问题相对于临床检测更为严重。其实PCR假阳

性的问题是比较单纯的，一般仅涉及污染和引物的非特异性问题。而污染可以通过严格的实验室管理，合

理的环境设置，以及加入UNG酶抗污染基本可以解决，而引物的非特异性问题基本属于厂家试剂质量问

题。而PCR的假阴性却不同，它涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节，十分复杂。就临床而言，

大三阳检出率低、甚至于GC镜下都很多时，PCR仍为阴性的事情也经常发生，可见假阴性问题的严重性。

就PCR假阴性问题总体来说有如下因素:

一.仪器因素

PCR实验对仪器的依赖性是很高的，离心机、扩增仪都是造成PCR假阴性的因素。扩增仪的主要问

题是孔间差，引起扩增失败可扩增效率降低。而离心机的影响则更容易被忽视。国内使用离心机很少使用

离心加速度（XXXg）作为参数指标，而常使用转数作为参数指标，这里就存在着一个问题，由于离心机

的大小不同，有效跳心半径也不相同，因此同样的转速所产生的离心力相差很大（有的在数倍以上），所以

在相同的离心时间下，有可能模板并没有离心下来，造成PCR假阴性。这个问题在其他实验也有，但因

基他实验都是测定大分子蛋白沉淀，对离心的速度要求较低所以不太明显。建议使用小型台式离心机的实

验要注意一下这个问题。

二.试剂质量问题

PCR实验的成功与否试剂的质量至关重要，试剂的质量问题涉及多个方面：细胞的裂解：模板的抽提：

引物位点的选择；Taq的的活性等等。其中任环节出了问题都会引起结果的假阴性。这些都是试剂质量

的问题，因此选用高质量的PCR试剂非常重要。

三.核酸模板问题

核酸模板质量问题是制约PCR最重要的因素之一。核酸模板在扩增区出现断裂、蛋白粘附、空间位

阻等模板质量问题都有可能引起扩增失败造成结果的假阴性或定量不准确。由于无论什么提取方法都不可

能得到完全理想化的核酸模板，因此核酸模板质量虽然与试剂的质量有关，但它不可能由试剂质量完全解

决。

核酸模板问题除了模板本身的问题外，还存在模板溶液中抑制Taq醒活性成分（如某些蛋白、禹子等）

作用，而导致扩增效率降低甚至扩增失败的问题。对此，有人提倡进行模板纯化，效果较为明显。但另一

个问题又出现了，那就是怎样保证纯化的回收率问题。总之，核酸模板问题是不可避免的问题，只能努力

去减少。

四.操作人员素质问题

PCR实验的环节很多，而且对每一环节的质量要求都很高，例如少加、漏加试剂、离心不充分、循环

参数设计错误、对于RNA抽提降解、逆转录失败等等都能造成结果的假阴性。因此要求PCR的实验操作

人员有很好的素质，能够严格遵守操作规程，并能敏锐的发现问题和解决问题。

五,其他

PCR实验中从样品的采集、运输、保存开始就可以引起结果的假阴性，而对于病原体检测（如HBV）

在人体血液系统出现有周期性变化也是值得注意的因素。

克隆PCR产物问题与解答

1）克隆PCR产物的最优条件是什么？

最佳插入片段：载体比需实验确定。1：1（插入片段：载体）常为最佳比，摩尔数比1：8或8：1也行。

应测定比值范围。连接用5W2X连接液，50ng质粒DNA,1Weiss单位的T4连委酶，插入片段共10叽

室温保温1小时，或40c过夜。在这2种温度下，缺T•凸出端的载体会自连，产生蓝斑。室温保温1小

时能满足大多数克隆要求，为提高连接效率，需40c过夜。

2）PCR产物是否需要用凝胶纯化？

如凝胶分析扩增产物只有一条带，不需要用凝胶纯化。如可见其他杂带，可能是积累了大量引物的二聚体。

少量的引物二聚体的摩尔数也很高，这会产生高比例的带有引物二聚体的克隆，而非目的插入片段。为此

需在克隆前做凝胶纯化。

3）如果没有回收到目的片段，还需要作什么对照实验？

A）涂布未转化的感受态细胞。

如有菌落，表明氨羊失效，或污染上带有氮节抗型的质粒，或产生氮羊抗型的菌落。

B）转化完整质粒，计算菌落生长数，测定转化效率。

例如，将1ug/ul质粒1:100稀释,1ul用于100W感受态细胞转化。用SOC稀释到1000W后，用100W

铺板。培养过夜，产生1000个菌落。转化率为：产生菌落的总数/铺板DNA的总量。

铺板DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。具体而言转化用10ngDNA,用SOC稀释到1000u

后含10ngDNA,用1/10铺板，共用1ngDNA。转化率为：

1000克隆X10（3次方）ng/铺板1ngDNAug=10（6次方）cfu/ug

转化pGEM・T应用10（8次方）cfu/ug感受态细胞

如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。

C）如用pGEM-T正对照，或PCR产物，产生＞20-40蓝斑（用指定步骤10（8次方）cfu/ug感受态细

胞），表明载体失去T。可能是连接酶污染了核酸酶。T4DNA连接酶（M1801,M1804,M1794）质量标

准好无核酸酶污染，不应用其它来源的T4DNA连接酸替换。

D）用pGEM-T或pGEM-TEasy载体，连接pGEM-T正对照，转化高频率感受态细胞（10（8次方）cfu/ug）,

按照指定的实验步骤，可得100个菌落，其中60%应为白斑，如产生＞2»40蓝斑，没有菌落或少有菌落，

连接有问题。

4）对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题？

A）连接用室温保温1小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需40c过夜。

B）插入片段带有污染，使3,-T缺失，或抑制连接，抑制转化。为此，将插入片段和pGEM・T正对照混合,

再连接。如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核

酸酶，使pGEM-T或pGEM-TEasy载体3,-T缺失。

C）插入片段不适于连接。用凝胶纯化的插入片段，因受UV过度照射，时有发生。UV过度照射会产生嗑

咤二聚体，不利于连接，DNA必需重新纯化。

D）带有修复功能的耐热DNA聚合酶的扩增产物末端无A,后者是pGEM-T或pGEM・TEasv教体克隆

所需。加TaqDNA聚合酶和核昔酸可在末端加A。详情查pGEM-TpGEM-TEasy载体技术资料（TM042）。

E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和重排，

需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如SURE细胞

PCR反应中Taq酶的选择

随着分子生物学研究发展的不断厂泛和深入，PCR已成为一门相当成熟的常规技术，而热

聚合酶（即Taq酶）的合理选择是PCR成败与否的一个关键因素。目前市面上有多种Taq

酶，能够满足多方面的实验需要。那么，如何选择最合适的Taq酶？根据用户经常考虑的指

标，如特异性、保真性、耐热性、扩增速率、扩增片段长度、能否进行复杂模板扩增以及优

化条件难易等等，我们在这儿将主要的Taq酶归归类，其性质、用途也就一目了然了。

高特异性Taq酶

高度特异性地扩增所需的片段是PCR最基本的要求，影响PCR特异性的因素很多，包括

模板、引物性质及质量、反应条件的控制等等，而高特异性T