高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测方法编制说明

PAGE3《高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种PCR检测方法》编制说明1.项目背景，包括产业现状、立项背景及必要性等。本标准的提出是根据《中华人民共和国渔业法》、《关于创新体制机制推进农业绿色发展的意见》、《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》、《水产养殖动物疫病防控指南》等国家政策文件对水产养殖绿色发展的要求，积极开发高效、精准并且可以现场应用的病害检测技术，对于支撑我国水产养殖病害综合防控技术体系建设和推进水产养殖业绿色高质量发展具有重要意义。美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae，PDD）是弧菌科发光杆菌属美人鱼发光杆菌（Photobacteriumdamselae）的一个亚种，广泛分布于全球海洋环境中，可以感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟、鲸豚类等不同的海洋动物发病，对人也有一定的致病性。PDD首次分离于1971年发生的一起“未知海洋弧菌”感染人类伤口的事件。而后，该菌于1981年再次从患病斑鳍光鳃鱼（Chromispunctipinnis）的皮肤溃疡病灶处被分离出来，被命名为美人鱼弧菌（Vibriodamsela），并报道于Science杂志。20世纪90年代，Smith等人将其归为发光杆菌属，并重新命名为美人鱼发光杆菌美人鱼亚种，与鱼类巴斯德氏菌病的病原美人鱼发光杆菌杀鱼亚种（P.damselaesubsp.piscicida）同种。PDD不仅是多种海水养殖动物的病原，还可对人类导致机会性感染。鱼类在感染PDD之后的典型特征为局部出血和体表溃疡性损伤，而人类伤口在感染PDD之后，往往会形成大疱和明显的水肿，并且有可能发展为坏死性筋膜炎，多器官衰竭。根据现有的文献报道，PDD主要是因鱼刺、鱼钩和水中杂物（如木块）等扎伤后接触伤口而感染人。该菌在近海海水环境中广泛分布，不仅会感染养殖动物发病从而对养殖生产造成经济损失，还会对海水养殖从业者、海滨浴场游客、海上工程作业人员等构成一些潜在的公共卫生风险，应引起足够的重视PDD的致病性主要由四种不同的毒素决定，分别是由毒力质粒pPHDD1编码的damselysin（Dly）和phobalysinP（PhlyP），以及由染色体编码的phobalysinC(PhlyC)和磷脂酶PlpV。其中Dly由毒力基因dly编码，是一种对鞘磷脂表现高活性的D-磷脂酶；PlpV由毒力基因plpV编码，是一种A2-磷脂酶；PhlyP和PhlyC都是穿孔毒素，分别由毒力基因hlyApl和hlyAch编码，这四种毒素都通过II型分泌系统分泌。穿孔毒素PhlyP与PhlyC之间的加强作用，以及两种磷脂酶（Dly和PlpV）与两种穿孔毒素（PhlyP和PhlyC）之间的协同作用可以使菌株对鱼类的致病力达到最大。此外，PDD菌株的染色体还能编码一种胶原酶ColP，这种毒素对菌株的致病性起次要作用。而在诸多致病因子中，携带dly基因是决定PDD对鱼类致病性强弱的主要毒力基因。到目前为止，我国境内PDD感染海水养殖动物的文献报道集中于少量的发病案例和病原学报道，该菌被认为是我国海水养殖产业近几年的新发病原之一。从已有的研究看，PDD可以感染我国从南方至北方的多种海水经济动物，如鞍带石斑鱼（Epinepheluslanceolatus）、半滑舌鳎（Cynoglossussemilaevis）、许氏平鲉（Sebastesschlegeli）、凡纳滨对虾（Penaeusvannamei）等，没有表现出明显的地域或宿主特异性。以山东省长岛海洋生态文明综合试验区周边海域为例，该海域是我国北方最大的深水网箱养殖区，现有中大型深水网箱738个，海水网箱总养殖水体达到63万m³。，主养品种为许氏平鲉，年养殖产量在1000吨左右。但近10年来，该地区网箱养殖的许氏平鲉连续在高温季节暴发流行性的皮肤溃疡病，该病具有传播速度快、致死率高等显著特点，发病期间单口网箱的累计死亡率最高超过了60%（数据来源于长岛海洋生态文明综合试验区海洋经济促进中心的调研报告），导致约30%的网箱养殖业主近几年放弃养殖、空置网箱，经济损失惨重。本标准起草人在该地区针对该病进行了连续两年的系统性流行病学调查，不仅充分证实PDD是该病的致病原，也从这一养殖海区不同养殖时期陆续分离获得了11株PDD菌株。后续的病原学研究结果表明，这11株菌株和本实验室保存的其他来源的PDD菌株不仅生理生化指标、抗生素药物敏感性等常规表型指标存在较明显的差异，与致病力紧密相关的溶血能力也表现了非常明显的差异。多次人工感染实验也验证，这些菌株对许氏平鲉的致病力也存在极为明显的差异。同为高浓度的活菌液注射感染，致病力强的菌株可以导致实验鱼在极短的时间内就全部死亡，而其他的一些PDD菌株注射后受试鱼却无死亡现象发生。事实上，以生理生化指标和对宿主致病力的强弱作为评判依据，不同PDD菌株在全球范围内也表现了表型特征多样化的现象。随着我国海水养殖产业的转型升级，深远海养殖被确认为拓展海水养殖空间的战略发展方向。目前，山东省已经进行了大型网箱、养殖工船等深远海养殖模式的先行先试，而许氏平鲉就是深远海养殖的主要品种之一。参照以往的产业经验，高密度的养殖模式在发展的过程中往往摆脱不了病害问题的制约。本标准起草人团队前期的研究已经证实，高致病性PDD是导致网箱养殖许氏平鲉败血性皮肤溃疡症的主要致病原，而海水环境中的PDD菌株存在显著的致病性差异，部分低致病性的PDD菌株即使感染也不会诱发疾病。因此，建立针对高致病性PDD菌株的检测技术和标准，实现对不同致病力PDD菌株的差异化检测，对于深远海养殖产业中实现对疾病的精准防控是十分有必要的。根据国家标准全文公开系统和中国农业标准网的搜索，仅查找到国家标准《饲料中副溶血性弧菌的检测》（GB/T26426-2010）、《食品微生物检验副溶血性弧菌检验》（GB4789.7-2013），未见有关美人鱼发光杆菌及其检测技术标准或规范的报道。制定高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种检测技术规程，对于指导水产养殖从业者科学规范地进行精准化的病害检测，降低疾病发生风险，提高疾病防控效率具有指导作用，也为推进我国水产养殖产业的绿色可持续发展提供技术支撑，具有突出的经济和社会效益。2.工作简况，包括任务来源、协作单位、主要工作过程、编写组成员及其所做的主要工作等。（1）任务来源本标准的起草和制订来源于山东水产学会团体标准制订项目。（2）协作单位本标准的起草由中国水产科学研究院黄海水产研究所作为牵头单位，联合山东信得科技股份有限公司和山东信达基因科技有限公司作为协作单位共同完成。其中，中国水产科学研究院黄海水产研究所负责完成标准的编制以及标准化测试、适用性评价等工作。山东信得科技股份有限公司和山东信达基因科技有限公司，主要负责标准技术参数的验证和示范。（3）主要工作过程为更好地完成标准的制订工作，标准起草团队从以下几个方面开展了工作：1）标准立项前，团队成员已进行了相关技术资料的收集。标准立项通知下达后，成立了专门的标准起草小组，制定工作计划，落实实施方案。2）学习有关政策法规，广泛收集有关标准和研究成果，包括GB/T1.1-2020《标准化工作导则》、GB/T6682-2008《分析实验室用水规格和试验方法》、GB19489-2008《实验室生物安全通用要求》、SC/T7014-2006《水生动物检疫实验技术规范》、SC/T7201.1-2006《鱼类细菌病检疫技术规程第1部分：通用技术》、SC/T7015-2011《染疫水生动物无害化处理规程》、SN/T2102.1-2008《食源性病原体PCR检测技术规范第1部分：通用要求和定义》等标准以及国家和农业部有关质量管理规定、产业政策等文件。3）标准编制组收集了国内外相关资料，在国内的海水鱼类养殖场、原良种场、网箱养殖企业、深远海养殖企业进行了系统的流行病学调查，与相关技术人员进行了深入的交流，并充分征求科研、管理等相关部门人员的意见，在总结各方面意见的基础上确定标准的技术内容，于2023年6月形成标准的征求意见稿和编制说明。4）起草小组于2023年8月份就形成的标准草案征求意见稿及编制说明在全国范围内公开征求专家意见（征求意见单位及回函单位不少于20家），征求意见的专家单位包括中国海洋大学、江苏海洋大学、宁波大学、西南大学、海南大学、中国水产科学研究院南海水产研究所、中国水产科学研究院东海水产研究所、山东省海洋科学研究院等，咨询专家为长期从事水产养殖研究的高级专业技术人员，对标准征求意见稿提出初步的意见和建议，征求意见的时间不少于30天。标准起草小组于10月底收到了全部20为专家的返回意见，并对返回的意见进行汇总和整理，按照专家意见对标准征求意见稿进行修订，对标准征求意见稿完善后提交秘书处，组织相关专家进行评审。（4）编写组成员及其所做的主要工作编写组成员为张正、于永翔、王印庚、罗展、王春元、马广斌、赵永伟、张世佳。编写组成员主要负责标准制订工作的组织、协调，相关资料的查阅、收集，标准文本及编制说明的起草、撰写，组织召开研讨会，通过现场考察、电子邮件、传真、电话等方式，征集、整理和归纳相关的意见、标准送审等。所做的主要工作见表1。表1编写组成员及其所做的主要工作姓名工作单位承担的工作3.标准编制原则和确定标准主要内容（如技术指标、参数、公式、性能要求、试验方法、检验规则等）的论据（包括试验、统计数据），修订标准时，应当列出新、旧标准水平的对比。（1）标准编制原则本标准的提出是根据《关于加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》、《关于创新体制机制推进农业绿色发展的意见》等国家政策文件对水产养殖绿色发展的要求，积极开发高效、精准并且可以现场应用的病原检测技术并制定技术规程，符合我国有关水产动物病原检测、疫病诊断的规章及规范性文件要求。标准起草过程中，按照GB/T1.1-2020《标准化工作导则第1部分：标准的结构和编写》给出的规则起草制定，为新制订标准。标准文本中能直接引用的标准尽量引用，相关内容不再在本标准中出现。（2）确定标准主要内容的论据1）范围限定了本标准的适用范围是进行高致病性PDD菌株的PCR检测。2）规范性引用文件规定了对于本标准的制订和应用不可缺少的参考标准、规范和其他文件。列举的引用文件中，凡注日期的文件，仅注日期的版本适用于本标准的参考引用，凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于标准的参考引用。3）术语和定义确定了本标准适用的检测对象为高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（high-virulentPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae）美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacteriumdamselaesubsp.damselae）是弧菌科发光杆菌属美人鱼发光杆菌（Photobacteriumdamselae）的一个亚种，广泛分布于全球海洋环境中，可以感染鱼类、甲壳类、软体动物、海龟、鲸豚类等不同的海洋动物发病，对人也有致病性。该菌种的不同菌株因携带的毒力基因不同，对宿主呈现出高致病性、低致病性和无致病性的致病力表型差异。本标准界定的高致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种是指感染鱼类宿主后能引起发病，最短可在数小时内造成宿主死亡，从而引发流行性疾病的菌株。4）PCR引物本标准的技术依据是通过检测PDD菌株携带的不同毒力基因，从而实现对菌株致病力差异性的区分。检测过程中共使用了两对PCR引物，包括用于检测位于菌株染色体上hlyB基因的特异性引物，以及用于检测位于菌株毒性质粒上dly基因的特异性引物。hlyB基因是一部分致病性细菌溶血素毒力系统中一个重要的毒力基因，位于细菌染色体上，主要表达溶血素转运蛋白等毒力因子，它并不是像16srDNA基因和gyrB基因等一样是一个通用型的细菌基因，而是只在一部分细菌中才有，并且其中的部分序列高度保守，具有很好的种间识别性。而dly基因是目前已经确认的只有致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的高毒力质粒才携带的重要毒力基因，主要表达溶血素蛋白。这一基因位于质粒上，会随着质粒一同丢失，高致病性菌株在丢失这一基因后会变为低致病性或非致病性菌株，所以是作为鉴别美人鱼发光杆菌美人鱼亚种是否具有高致病力的理想靶标基因。检测hlyB基因的存在主要确认被检菌株为PDD，检测dly基因的存在主要确认被检的PDD菌株携带有高致病性的毒力基因。两对PCR特异引物序列如下：①hlyB基因的特异引物正向序列hlyB-F:5'-ACTCGCTTACTTGAATCGGAAAT-3'反向序列hlyB-R:5'-TCACGAAAGACATTGAGCATC-3'②dly基因的特异引物正向序列dly-F:5'-TTTGGACGAGCGGTCCATTT-3'反向序列dly-R:5'-GGAGCCCAATCTTGACCAGG-3'5）仪器设备和试剂耗材规定了用于开展高致病性PDD菌株检测所需的基本条件要求，包括主要的仪器设备，试剂和耗材。6）检测步骤依据前期的实验研究和技术验证结果，确定了开展高致病性PDD菌株PCR检测的基本实验步骤，包括三个步骤：①待检样品及阴性、阳性对照组的核酸模板制备：详细描述了对待检病样样品的采集和前处理过程，及相关的技术参数要求，确保最终制备出符合检测要求的DNA核酸模板。②PCR反应体系的配置：确定了分别用于检测hlyB基因和dly基因的两个独立的PCR反应体系，以及阴性、阳性对照组PCR反应体系的组成。③PCR扩增：确定了进行hlyB基因和dly基因PCR检测的反应条件参数、产物电泳条件，以及结果观察方法。7）结果判定主要包括两部分内容：①检测结果成立的条件：详细描述了被检样品判定为高致病性PDD感染的条件，即hlyB基因PCR扩增产物电泳检测后在344bp的位置出现特异性条带，dly基因PCR扩增产物电泳检测后在695bp的位置出现特异性条带，且阴性对照PCR扩增产物电泳后均未出现条带，则检测结果成立。②结果判定的方法：对检测结果可能出现的多种情况及其结果判定进行了详细说明，分为四种情况：一是在检测结果成立的前提下，即hlyB基因和dly基因两条特异性条带同时出现时，且阴性对照未出现条带，可判定为高致病性PDD感染。二是在检测结果不成立的前提下，hlyB基因出现特异性条带，而dly基因未出现条带，且阴性对照未出现条带，可判定为PDD感染，但不是高致病菌株。三是在检测结果不成立的前提下，只要hlyB基因未出现特异性条带，无论dly基因是否出现特异性条带，即可判定该样品不是PDD感染。四是检测过程中也可以选择高致病PDD菌株作为阳性对照。若阳性对照hlyB基因和dly基因任意一个未出现特异性条带，证明本次检测存在操作失误，再次重复该检测。8）防止交叉污染和废弃物处理的措施引用了其他已颁布的国标和行标，对检测过程中防止交叉污染，以及检测过程中产生的废弃物和检测完成后样品的处理方式进行了规定。4.主要试验（或验证）的分析、综述报告，技术经济论证，预期的经济效果。（1）主要试验（或验证）的分析本标准起草人在过去的研究中，共收集保存了46株PDD菌株。这些菌株来自国内河北、天津、山东、江苏、浙江、福建、海南7个省市，分离自大菱鲆、褐牙鲆、半滑舌鳎、许氏平鲉、大泷六线鱼、褐点石斑鱼、珍珠龙胆石斑鱼、赤点石斑鱼、大黄鱼、南美白对虾、高鳍鲨、皱纹盘鲍等12个海水养殖品种，时间跨度长达11年，基本上覆盖了我国的主要海水养殖区域。在对这些菌株的持续研究中，发现不同的PDD菌株在生理生化指标、抗生素药物敏感性、溶血和磷脂酶表型，以及对鱼类宿主的致病力方面都存在着极为明显的差异。因此，开展不同致病力菌株的差异化检测，对在生产中高效、精准的预防PDD感染就尤为重要。通过对高致病力、低致病力和无致病力的PDD菌株进行全基因组的比较分析，发现其致病力的差异主要是由于携带不同的毒力基因而导致的。通过深入的基因组解析，并检索了大量文献，最终选定位于染色体上的hlyB基因和位于毒性质粒上的dly基因作为检测高致病性PDD菌株的鉴别基因。其中，位于染色体上的hlyB基因是所有PDD菌株都携带的毒力系统基因之一，其基因序列相对保守，主要用于鉴别被检菌株为PDD菌株。而dly基因是高致病性PDD菌株毒性质粒携带的特有毒力基因，只有携带该基因的PDD菌株才会表现出极强的致病力，也是鉴别高致病性PDD菌株的标志性基因。由于该基因位于菌株的质粒上，因此存在质粒自然转移的风险，有可能会将dly基因转入其他非PDD菌株。因此，本标准的技术思路是通过对hlyB基因和dly基因同步检测的方式，来实现对高致病性PDD菌株的快速检测鉴别。（2）综述报告确定上述技术思路后，本标准起草人团队对hlyB基因和dly基因进行了全序列分析，并挑选了其中高度保守的一段序列，设计了特异性引物，并委托相关公司进行了引物合成。随后，从实验室的菌种库中挑选出23株不同的细菌菌株（表1）进行了hlyB基因引物特异性的检测，实验结果显示只有3株PDD菌株在344bp的位置出现条带，其余的20株非PDD菌株均未出现条带，证明所设计的hlyB基因对PDD菌株具有较好的特异性，可以用于对PDD菌株的特异性检测。表1用于验证hlyB基因引物特异性的菌株序号菌株拉丁名编号来源1美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1605实验室分离2美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1608实验室分离3美人鱼发光杆菌美人鱼亚种Photobacteriumdamselaesubsp.damselaePDD1808实验室分离4轮虫弧菌vibriorotiferianusVR1实验室分离5轮虫弧菌vibriorotiferianusVR2实验室分离6轮虫弧菌vibriorotiferianusVR3实验室分离7哈维氏弧菌VibroharveyiVHBZ0001购自北微所8哈维氏弧菌VibroharveyiVHBZ0002实验室分离9哈维氏弧菌VibroharveyiVHBZ0003实验室分离10鳗弧菌VibrioanguillarumVABZ0001购自北微所11鳗弧菌VibrioanguillarumVABZ0002实验室分离12灿烂弧菌VibriosplendidusVSBZ0001购自北微所13灿烂弧菌VibriosplendidusVSBZ0002实验室分离14副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0001购自北微所15副溶血弧菌VibrioparahaemolyticusVPBZ0002实验室分离16溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0003购自北微所17溶藻弧菌VibrioalginolyticusVABZ0004实验室分离18费氏弧菌VibriofischeriSm02112702A购自北微所19大菱鲆弧菌VibrioscophtalmiVS1实验室分离20嗜环弧菌VibriocyclitrophicusVC1实验室分离21大肠杆菌EscherichiaColiTrans1-T1实验室分离22大肠杆菌EscherichiaColiTrans1-T2实验室分离23大肠杆菌EscherichiaColiTrans1-T3实验室分离完成了对hlyB基因引物特异性的验证后，本标准起草人团队又从实验室的菌种库中挑选出25株不同来源的PDD菌株，其中包括已经完成全基因组解析和致病力验证的2株高致病性菌株，分别用设计的hlyB基因引物和dly基因引物对这25株PDD开展了特异性检测，结果如图1和图2所示，25株PDD菌株的hlyB基因引物全部出现了特异性条带，而只有其中的2株高致病性菌株的dly基因引物出现了特异性条带，证实本标准的技术思路可以实现对高致病性PDD菌株的精准检测。图1用hlyB基因引物对25株PDD菌株的PCR检测结果图2用dly基因引物对25株PDD菌株的PCR检测结果（3）技术经济论证本标准面向海水养殖产业中病害防控的痛点问题，规定了高致病性PDD菌株的PCR检测方法，适用于鱼类、对虾等主要养殖品种对PDD感染检测的技术需求。采用本标准进行检测，能够准确鉴别出具有高致病性的PDD菌株，实现对PDD感染的精准防控。标准的制订，对养殖产业中的病害临床防控具有重要的指导意义，能够有效节约养殖生产单位在防控PDD疾病感染过程中的人力和物力投入。（4）预期的经济效益2019年，农业农村部联合十部委共同印发了《关于加快推进水产养殖业绿色发展的意见》，其中第十五条“加强疫病防控”中提出了应“提高重大疫病防控和应急处置能力”。2022年，山东省委、省政府印发了《海洋强省建设行动计划》，其中再次强调了要发展深远海养殖，推进近海渔业向深远海发展。PDD是本标准起草人团队在近十年的流行病调查中发现的感染许氏平鲉、大黄鱼等深远海养殖鱼类的新兴病原菌，可引起严重的疾病和导致极高的死亡率。但不同PDD菌株的致病力存在显著的差异性，部分无致病力PDD菌株即使感染鱼类宿主也不会导致疾病和死亡。因此，在养殖生产中精准的检测高致病性PDD菌株就能够显著提高疾病防控的有效性。本标准制订实施后，对养殖企业预期的经济效益体现在两方面，一是建立的PDD检测方法可以为生产中提供技术规范，通过对病原的检测并提前采取措施实现对疾病的有效预防，从而显著降低疾病的发生风险，减少病害损失。二是通过对不同致病力PDD菌株的精准检测，使对病原感染的防控更有针对性，更加精准化，可以避免一些不必要的投入品（如药物）的使用，为企业节约养殖成本，同时也有利于保护养殖水域的生态环境，创造较好的生态效益。5.标准涉及的相关知识产权说明。通过文献检索，与本标准内容直接相关的知识产权有：①国家发明专利，强致病性和非强致病性美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的快速鉴定PCR反应体系，专利号ZL201911178338.5，授权日期2020年7月3日。②国家发明专利，适用于美人鱼发光杆菌美人鱼亚种快速检测的RPA反应体系，专利号ZL202010558367.0，授权日期2021年8月10日。③上海海洋大学硕士学位论文，不同美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株对许氏平鲉致病力差异分析，论文作者施琳妮，论文提交时间2019年。④上海海洋大学硕士学位论文，两种海水鱼类致病菌现场快速检测技术的建立与应用，论文作者陈京，论文提交时间2020年。上述知识产权全部为本标准起草人团队完成并获得，不存在知识产权纠纷的情况。6.采用国际标准和国外先进标准的程度，以及与国际、国外同类标准水平的对比情况，或与测试的国外样品有关数据的对比情况。通过对国家标准全文公开系统（/bzgk/gb/）、中国农业标准网（/）和中国知网（）等标准检索网站的搜索查询，未检索到美人鱼发光杆菌美人鱼亚种检测相关的国内外标准，仅检索到《饲料中副溶血性弧菌的检测》（GB/T26426-2010）、《食品微生物检验副溶血性弧菌检验》（GB4789.7-2013）等内容相近但适用对象不同的标准。因此，本标准属于新制订的标准。本标准在编制过程中，查阅和参考了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种致病机理等方面的最新文献资料，同时引用了SC/T7014-2006、SC/T201.1-2006、SC/T7015-2011、SN/T2102.1-2008等有关水生动物病原检疫、染病动物无害化处理等方面的行业标准，并结合了美人鱼发光杆菌美人鱼亚种在我国海水养殖产业中的流行情况和致病特点，制订了本标准，以使本标准的技术内容更加科学、完善，为在养殖生产中高效的开展病原检测提供技术依据。7.与现有相关法律法规及相关标准的协调性。本标准符合《中华人民共和国渔业法》和《中华人民共和国动物防疫法》的规定；符合农业农村部印发的《农业绿色发展技术导则（2018-2030年）》和《加快推进水产养殖业绿色发展的若干意见》的相关要求；符合农业农村部渔业渔政管理局印发的《水产养殖动物疾病防控指南（试行）》中“养殖场应定期开展水产养殖动物疾病监测和检测”的指导原则。本标准内容与现行的各项法律法规、强制性标准及各部委规章相协调，均无冲突。8.重大意见分歧的处理经过和依据。本标准的制订立项、内容审定和颁布实施都将履行专家评审制度，广泛征求来自研究、生产、检测、管理等单位的专家意见。截止目前，专家们对标准内容细节提出了很多修改和完善的建议，但并未对标准的立项和制订提出重大的分歧性意见。如果在后续的审定过程中出现重大分歧意见，将根据具体的意见内容，按照标准审定程序，征集更多的专家意见，并按照少数服从多数的原则，与意见分歧专家进行当面沟通并协商解决。9.贯彻标准的要求和措施建议（包括组织措施、技术措施、过渡办法等内容）。本标准的发布，将为海水养殖生产中精准的检测PDD感染建立有章可循的技术标准，从而指导养殖企业进行科学防控，降低疾病发生风险，保障渔业环境安全和养成水产品的质量安全。标准起草人团队将认真做好标准文本的制订、修改和送交评审等各项工作，同时在评审的过程中加强与评审专家、养殖企业、主管部门等的联系沟通，利用各种渠道做好制订本标准的目的、意义、精神、技术内容方面的宣贯工作，宣传标准化工作的重要性。同时，团队成员将结合自身的科研工作，加强对不同海水养殖系统内高致病性PDD菌株的监测力度，定期对多种养殖生境下水产动物病原携带情况进行跟踪检测，对高致病性PDD菌株的留存状况和致病风险进行排查，从而推动本标准内容在养殖企业中得以有效的实施，降低高致病性PDD菌株感染海水养殖动物发病的概率，减少因病损失。此外，鼓励不同的科研单位和养殖生产企业结合科研生产的实际情况，针对本标准技术进行优化和升级，为今后修订本标准做好技术储备。10.其他应予说明的事项。无。主要参考文献刘潇,张正,王丽芳,等.海南地区与环渤海湾美人鱼发光杆菌美人鱼亚种水产动物分离株的表型与遗传特征分析[J].微生物学报,2021,61(07):2101-2111.FouzB,LarsenJL,NielsenBB,etal.CharacterizationofVibriodamselastrainsisolatedfromturbotScophthalmusmaximusinSpain[J].DiseasesofAquaticOrganisms,1992,12(3):155-166.TakahashiH,MiyaS,KimuraB,etal.DifferenceofgenotypicandphenotypiccharacteristicsandpathogenicitypotentialofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaebetweenclinicalandenvironmentalisolatesfromJapan[J].MicrobialPathogenesis,2008,45(2):150-158.RivasAJ,LemosML,OsorioCR.Photobacteriumdamselaesubsp.damselae,abacteriumpathogenicformarineanimalsandhumans[J].FrontiersinMicrobiology,2013,4.KregerAS.CytolyticactivityandvirulenceofVibriodamsela[J].InfectImmun,1984,44(2):326-331.BaladoM,PuentesB,CouceiroL,etal.SecretedcitrateservesasironcarrierforthemarinepathogenPhotobacteriumdamselaesubspdamselae[J].FrontiersinCellularandInfectionMicrobiology,2017,7:361.PuentesB,BaladoM,Bermúdez-CrespoJ,etal.AproteomicanalysisoftheironresponseofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaerevealsmetabolicadaptationstoironlevelschangesandnovelpotentialvirulencefactors[J].VeterinaryMicrobiology,2017,201:257-264.LoveM,Teebken-fisherD,HoseJE,FarmerJJ,HickmanFW,FanningGR.1981.Vibriodamsela,aMarineBacterium,CausesSkinUlcersontheDamselfishChromispunctipinnis.Science,214:1139–1140.KettererP,EavesL.1992.Deathsincaptiveeels(Anguilareinhardtii)duetoPhotobacterium(Vibrio)damsela.AustralianVeterinaryJournal,69:203–204.LabellaA,VidaM,AlonsoMC,InfanteC,CardenasS,Lopez-RomaldeS,ManchadoM,BorregoJJ.2006.FirstisolationofPhotobacteriumdamselaessp.damselaefromculturedredbandedseabream,PagrusaurigaValenciennes,inSpain.JournalofFishDiseases,29:175–179.VaseeharanB,SundararajS,MuruganT,ChenJC.2007.Photobacteriumdamselaessp.damselaeassociatedwithdiseasedblacktigershrimpPenaeusmonodonFabriciusinIndia.LettersinAppliedMicrobiology,45:82–86.SongY-L,ChengW,WangC-H.1993.IsolationandcharacterizationofVibriodamselaInfectiousforculturedshrimpinTaiwan.JournalofInvertebratePathology,61:24–31.A.Lozano-León,C.R.Osorio,S.Nuñez,J.Martínez-UrtazaBM.2003.OccurrenceofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaeinbivavlvemolluscsfromNorthwestSpain.EuropeanAssociationofFishPathologists,23(1):40–44.ObendorfDL,CarsonJ,McManusTJ.1987.VibriodamselaInfectioninaStrandedLeatherbackTurtle(Dermochelyscoriacea).JournalofWildlifeDiseases,23(4):666–668.FujiokaRS,GrecoSB,CatesMB,SchroederJP.1988.VibriodamselafromwoundsinbottlenosedolphinsTursiopstruncatus.Diseasesofaquaticorganisms,4(1):1–8.LeeK,KimHK,SohnH,ChoY,ChoiY-M,JeongDG,KimJH.2018.GenomicinsightsintoPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaestrainKC-Na-1,isolatedfromthefinlessporpoise(Neophocaenaasiaeorientalis).MarineGenomics,37:26–30.GoodellKH,JordanMR,GrahamR,CassidyC,NasrawaySA.2004.RapidlyadvancingnecrotizingfasciitiscausedbyPhotobacterium(Vibrio)damsela:Ahyperaggressivevariant.CriticalCareMedicine,32:278–281.张晓君,秦国民,陈翠珍,房海,阎斌伦.2009.龙胆石斑鱼源美人鱼发光杆菌的生物学特性与系统发育学分析.渔业科学进展30:38–43.YanN,ZhangZQ,WuTL,ZhuJX,FuYF,HanHS,WangHB,ShiQM,GaoGS.2018.IsolationandidentificationofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselae(PDD)fromTongueSole.AnimalHusbandryandFeedScience,10(2):99–102.ZhangZ,YuY,WangK,WangY,JiangY,LiaoM,RongX.2019.FirstreportofskinulcerationcausedbyPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaeinnet-cageculturedblackrockfish(Sebastesschlegeli).Aquaculture503:1–7.WangZY,ShiCY,WangHL,WanXY,ZhangQL,SongXL,LiG,GongM,YeSG,XieGS,HuangJ.2020.AnovelresearchonisolationandcharacterizationofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaefromPacificwhiteshrimp,Penaeusvannamei,displayingblackgilldiseaseculturedinChina.Journaloffishdiseases,43(5):551-559.施琳妮,于永翔,姜勇,张正,王印庚,廖梅杰,荣小军.2019.不同来源美人鱼发光杆菌美人鱼亚种菌株表型差异性分析.海洋科学43:15–24.TercetiMS,VencesA,MatanzaXM,DalsgaardI,PedersenK,OsorioCR.2018.MolecularepidemiologyofPhotobacteriumdamselaesubsp.damselaeoutbreaksinmarinerainbowtroutfarmsrevealsextensivehorizontalgenetransferandhighgeneticdiversity.FrontiersinMicrobiology,9:Article2155.OsorioCR,VencesA,MatanzaXM,TercetiMS.2018.Photobacteriumdamselaesubsp.damselae,ageneralistpathogenwithuniquevirulencefactorsandhighgeneticdiversity.JournalofBacteriology,200:e00002-18.27.PedersenK,SkallHF,Lassen-NielsenAM,BjerrumL,OlesenNJ.2009.Photobacteriumdamselaesubsp.damselae,anemergingpathogeninDanishrainbowtrout,Oncorhynchusmykiss(Walbaum),mariculture.JournalofFishDiseases,32(5):465–472.TercetiMS,OgutH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