8发酵工艺控制1

8.发酵工艺控制8.1微生物发酵类型

1.

依据投料方式:分批发酵、补料分批发酵、连续发酵；

2.依据是否需氧：好氧发酵和厌氧发酵。

一、分批发酵、补料分批发酵、连续发酵1、分批发酵：指一次性投入料液，接种后在发酵过程中不再补入料液，一直到放罐的发酵方式。特点优点：操作简单，周期短，染菌几率小，在生产过程中产品质量容易掌握。缺点：不适于测定过程动力学，对基质浓度敏感的微生物，产率比较低。2、补料分批发酵:也称为补料分批培养(fed-batchcultureFBC)是指在分批培养过程中间歇或连续的补加一种或多种成分的新鲜料液的培养方法，又称为半连续发酵。补入时间：一般在生长期后，以维持生产期的稳定。

补料方式很多：连续流加、不连续流加、多周期流加等。优点：（1）解除了底物抑制、分解产物阻遏和产物反馈抑制。（2）可以避免在分批发酵中一次性投料过多，造成菌体大量生长和溶氧不足，降低发酵液的粘度。（3）使发酵过程最佳化。

3.连续发酵连续培养就是进入产物合成期后，开始以恒定的流速向发酵关内流加培养基，同时以相同的速度放出培养液，使发酵罐内的体积、菌体浓度、产物浓度保持恒定。特点优点：产率高、生产稳定，便于实现自动化控制。缺点：增加染菌几率，易造成菌种的退化。8.2发酵过程的代谢变化一、初级代谢产物发酵的代谢变化发酵过程中菌体的生长过程表现出：延迟期、对数生长期、静止期和死亡期等生长使特征。没有明显的产物合成期。二、次级代谢产物发酵的代谢变化发酵过程中的代谢变化一般分为：菌体生长期、产物合成期、菌体自溶期。

1、菌体生长阶段主要的代谢活动为：碳源和氮源等营养物质的分解代谢和菌体生长的合成代谢。2、产物合成阶段主要的代谢主要是：碳源和氮源等营养物质的分解代谢和产物的合成代谢。3、菌体自溶阶段菌体衰老，细胞开始自溶，氨氮含量增加，pH上升。8.3参数及检测1.参数常规的控制参数有：罐温、pH、溶氧、搅拌转数、空气流量、罐压、液位、基质浓度、产物浓度等。2.检测方法

在线检测：温度、pH、溶氧、搅拌、压力等。离位检测：基质浓度（残糖浓度）、产物浓度、菌体浓度等。8.4营养基质的影响及控制一、营养基质种类的影响及控制1.碳源碳源种类的影响：速效碳源有利于菌体的快速生长，但其分解产物有明显的阻遏作用；缓慢利用的碳源有利于延长代谢产物的合成。碳源浓度的影响：碳源丰富易造成繁殖过剩，对产物合成及氧的传递造成不良的影响。在工业上的控制，一般采用二者混合使用，并控制一定的浓度，在发酵过程中采用补料分批发酵的方法。2.氮源影响：同样包括种类和浓度的影响。工业生产中采用的措施：1）混合使用2）在发酵过程中补加氮源。3.磷酸盐

在工业生产中，通过在基础培养基中控制磷酸盐的亚适量，来减少磷酸盐的抑制作用。二、基质浓度对发酵的影响及控制1.影响：基质浓度过低，不能满足菌体生长的需求；基质浓度过丰富，也会影响菌体生长和产物的合成。2.控制：一般根据菌种的特性，通过补料维持在菌体半饥饿状态。8.5种子质量的影响及控制1.接种菌龄影响：年轻的种子，到发酵罐后生长缓慢，生长期延长，发酵周期延长；过老的种子，长表现过早衰老。控制：控制在菌体浓度接近高峰时移种，在对数生长期后期。2.接种量影响：接种量少迟滞期延长；过大会造成溶氧不足，影响菌丝和产物的合成。控制：根据菌种的生长繁殖速度及对溶氧的要求确定接种量。8.6温度的影响和控制一、影响1、温度对微生物生长的影响;2、温度对产物合成的影响;3、温度对产物合成方向的影响；4、温度对发酵液物理性质及氧的溶解度、传递的影响。二、影响发酵温度的因素发酵热是引起温度变化的主要因素。发酵热：即发酵过程中释放出的净热量单位J/(m3.h)，用Q发酵表示。

Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显热-Q辐射

种子罐热交换系统多用于加热，发酵罐多用于冷却。三、最适温度的选择和发酵温度的控制

选择最适温度应考虑两个方面：微生物的最适生长温度和产物合成的最适温度。控制：一般采取变温控制，同时在控制时注意灵活掌握。如溶氧条件差，补料不及时，培养基利用缓慢生长缓慢时，都要及时调整。8.7pH的影响及控制一、影响1、作用胞外弱酸或弱碱成为分子形式，进入细胞后影响胞内酶蛋白的解离度和电荷状态，改变酶的结构和功能，从而影响微生物的生长和产物合成。

2、影响细胞的形态；3、对代谢产物产生影响。

二、发酵过程中pH变化规律

1）大多数微生物生长适应的pH跨度为3-4的单位，其中最佳生长的pH跨度为0.5-1个单位。

2）多数微生物对最初的pH有一定的调节能力。3）培养温度高的微生物最适pH也相应高些。

4）在生长初期有pH高峰和pH低谷的变化。

5）微生物生长和产物合成的pH通常不同。6）pH变化和培养基中生理酸性物质和碱性物质的比例有关。三、发酵pH的选择选择最适pH的原则是：即有利于菌体的生长又最大限度的合成产物。

一般最适pH是根据实验结果来确定的。

四、控制方法1、实验发酵培养基的基础配方，使生理酸性物质和生理碱性物质有合适的配比，使发酵过程的pH在合适的范围内。2、在培养基中添加一定浓度的碳酸钙，以中和发酵过程中产生的酸。H++CaCO3——Ca2++H2O+CO2

3、在发酵过程中，通过补加酸、碱或补料的方式来控制。补料是最常用的方法。通过流加生理酸性物质或碱性物质进行调解。如葡萄糖、硫酸铵、氨水等。8.8溶氧的影响及控制一、需氧方面：1、微生物对氧需求的表示方法微生物的耗氧量用摄氧率和呼吸强度来表示。1）摄氧率（r）：单位体积培养液每小时的耗氧量。单位：mmol/L.h。2）呼吸强度（QO2）：单位重量的菌体（折干）每小时消耗氧的量，也称为氧比消耗速率。单位mmol/g.h。二者之间的关系：r=QO2.XX:发酵液中菌丝的浓度，g/L。2、影响微生物需氧量的因素1）培养基中的溶解氧浓度

因此，只有溶解氧达到临界氧浓度时，才能满足微生物对氧的需求。2）微生物的种类和生长阶段。3）培养基的组成：碳源的种类和浓度影响尤为显著。4）培养条件：温度。5）二氧化碳的浓度。二、供氧方面（一）氧在液体中的溶解特性1）温度:温度越高，氧的溶解度就越低。2）溶液的性质:溶质含量越高，氧的溶解度就越低。3）氧分压：氧分压越高，氧的溶解度就越高。（二）氧在溶液中的传递1、氧传递的阻力

氧的传递的阻力：气泡—气液界面—液膜—液相—液膜—固液界面—细胞团—细胞膜—细胞内

传递过程中的总推动力是气相与细胞内的氧分压差和浓度差。2、氧的传递方程式N=KLa

.(C*-CL)

N氧的传递速率mmol/L.hC*溶液中溶氧的饱和浓度mmol/LCL溶液中的溶氧浓度mmol/L

KL以浓度差为推动力的氧传质系数m/h

a比表面积，因为很难测定，所以将KLa

当成一项，称为容积传递系数s-1。（三）影响供氧的因素N=KLa

.(C*-CL)

1、影响氧传递推动力的因素(C*-CL)

是氧传递的推动力，因此只有提高C*，降低CL。但不符合生产现状或要求。2、影响KLa

的因素经生产实践证明，影响KLa

的主要因素有搅拌、空气流量、发酵液的理化性质等。可用下列经验式表示它们之间的关系：KLa=K〔(P/V)α·(υs)β·(ηapp)-ω〕P/V发酵罐搅拌功率kW/m3υs罐体垂直方向的空气直线速度m/hηapp发酵液的表观粘度Pa·

sK经验常数αβ–ω

经验常数，与搅拌器、空气分布器的形状等有关，一般通过实验测定。实验侧得α值在0.75～1.0，β在0.4～0.72，

1）搅拌功率的影响：搅拌功率越大，KLa越大。其中α与搅拌器的形状有关。搅拌的作用：将空气打碎成小气泡，增加气-液接触界面，提高氧的传递速率；同时使发酵液充分混合，液体中的固形物质保持悬浮状态。形状：在搅拌器的中央装有圆盘，在圆盘上装上搅拌叶，搅拌叶有平叶式、弯叶式、箭叶式。

挡板：为了克服搅拌器运转时产生的涡流,将径向流动改变为轴向流动,促使液体的激烈翻动。2）空气流速的影响：在一定范围内，随着流速的增加，KLa增加。但流速过大，引起气泛现象。而且实验证明搅拌功率的影响远大于空气流速的影响。因此，优先考虑搅拌功率。3）发酵液理化性质的影响：发酵液的粘度越大，越小。4）泡沫的影响：影响气液混合，降低容积氧传递系数。5）空气分布器和发酵罐结构的影响：使空气充分分散的空气分布器有利于溶氧的增加。发酵罐的结构包括罐的高径比是否合适、是否达到全挡板条件等。空气分布器有单管式个和环管式，目的使空气均匀分布。全挡板条件是指在一定转速下，随着罐内挡板的增加，搅拌轴功率不在增加时的挡板数。三、发酵过程的溶氧变化和溶氧浓度的控制1、发酵过程溶氧的变化2、溶氧浓度的控制

应从供氧和需氧两个方面考虑。在供氧方面：搅拌、空气流速、空气分布器和发酵罐结构影响KLa

，但这些参数在一定的条件下，很难再优化。所以在发酵液理化性质和需氧方面进行控制,使需氧量不超过设备的供氧能力。采取的措施：控制菌体的比生长速率，使其保持在比临界菌体浓度略高一点的水平，达到适和浓度。在工业上，还可通过调节发酵温度、液化培养基、中间补水，改善溶氧水平。8.9二氧化碳的影响及控制一、二氧化碳对发酵的影响1、发酵液中的二氧化碳对微生物的生长速度具有刺激或抑制作用。1）刺激作用：称之为CO2效应。环状芽孢杆菌、大肠杆菌和链孢霉的突变株需30%的浓度。2）抑制作用：酵母菌，青霉素菌丝形态随着CO2的增加形态发生改变，如青霉菌由丝状变为球状或酵母状细胞。2、对产物合成产生影响刺激作用：牛链球菌发酵产生多糖需5%的CO2，精氨酸发酵等。抑制作用：对抗生素发酵产生抑制作用。

3、对发酵液pH的影响。二、二氧化碳的控制二氧化碳在发酵液中的浓度受到许多因素的影响，如菌体的呼吸强度、发酵液的特性、通气搅拌和罐力等。控制原则：根据对发酵的影响情况而定。通气搅拌的大小可以调节二氧化碳的浓度。

8.10补料对发酵的影响一、分批补料的作用1.可以控制抑制性底物的浓度2.可以解除或减弱分解产物阻遏3.可以使发酵过程最佳化。二、补料的方法和速率的确定1.方法：一次性大量补入；少量多次；连续流加。目前采用的是连续流加。2.速率的确定：根据微生物对养分的消耗及所设定的发酵液中最低维持浓度而定。三、补料的依据和判断

根据：最常用的是残糖浓度、溶氧浓度和pH。

三者之间的关系：糖的浓度大，代谢加快，溶氧浓度降低；糖的浓度降低，利用氮源中提供能量，造成氨基积累，pH升高。

1.通过控制补料控制溶氧不低于临界值，将生长速率控制在中等水平，可以提高大肠杆菌的细胞密度和产物产率的提高。2.谷氨酸发酵过程中，摄氧率和基质消耗成线性关系，因此可以通过控制摄氧率控制补料速度。3.在青霉素发酵过程中，通过控制补料使菌体处于半饥饿状态，保证溶氧，提高青霉素的产量。

8.11泡沫的影响及控制一、泡沫对发酵的影响发酵液中存在一定的泡沫可以增加气液的接触面积，增加氧的传递。但大量的泡沫会对发酵带来很多不利的影响。1、泡沫过多造成“逃液”现象，给生产带来损失。2、减少发酵罐的装料系数，影响收率。3、泡沫升至罐顶，增加染菌的几率。4、消沫剂的加入对提取带来困难。二、泡沫产生的原因及类型1、产生的原因：

1）通气和搅拌，搅拌比通气引起泡沫的要大。

2）代谢产生的气体的逸出，和生长阶段有关。

3）培养基中蛋白质、代谢产物等表面活性物质的存在是产生泡沫的主要因素，糖增加了泡沫的稳定性。

4）灭菌温度高、冷却时间长都会使泡沫增加。2、泡沫的类型：1）机械性泡沫：存在于发酵液的液面上，气项所占比例较大，与液面有较明显的界限。如发酵前期的泡沫。2）流态泡沫：分散在发酵液中，比较稳定，与液面之间无明显的界限。四、泡沫的控制1、机械消沫物理消沫的方法，利用机械强烈的振动或压力改变而使泡沫破裂。罐内消沫：利用罐内的消沫桨罐外消沫：将泡沫引到罐外，通过喷嘴的加速作用或离心力消除泡沫。但消沫效果不理想，对流态泡沫几乎不起作用。仅作为消沫的辅助作用。

2、消沫剂消沫1）消沫剂的作用：降低泡沫的液膜的机械强度，或者降低液泡膜的表面张力。2）消沫剂的选择a、消沫剂要有一定的亲水性，保证在气-液界面上有一定的铺展性；

b、在低浓度时具有消泡活性；

c、具有持久的消泡或抑泡能力；

d、对微生物、人、动物无毒；

e、对产物提取不产生影响

f、对氧传递不产生影响；

g、成本低且耐高温。3）常用的消沫剂天然油脂，高碳醇、脂肪酸、酯类，聚醚类和硅酮类四大类。天然油脂：豆油、玉米油、棉籽油、菜籽油和动物油等。消沫能力差，用量大。只用在种子罐。

聚醚类：应用较多的是聚氧丙烯甘油（GP，抑泡剂）和聚氧乙烯氧丙烯甘油（GPE，消泡剂），它们以一定的比例混合的消沫剂又称为泡敌。它们的用量小为0.03%-0.035%，消泡效果是天然油脂的10倍。

抑泡剂GP亲水性较差，作用时间较短，常在配培养基时加入，起到抑制泡沫产生；消泡剂GPE亲水性好，作用时间长，在发酵过程中加入。8.12发酵终点的判断

一、发酵终点的判断标准：

1.经济因素2.对产品质量的影响3.特殊情况：染菌二、确定放罐指标产物的产量、过滤速度。

三、放罐工艺控制补料、通氨加消沫剂都为在不影响产物合成的情况下，节约控制。8.13发酵染菌的防治和处理染菌：指的是在发酵培养过程中侵入了有碍生产的其他微生物。无菌检查主要针对菌种制备、种子罐、发酵罐灭菌后和接种培养过程中。一、细菌的无菌检查1.方法1）肉汤培养法取样后，放置培养，每6小时观察一次。2）平板划线法3）显微观察法沙黄染色进行显微镜观察。生产上一般2-3种方法结合起来进行无菌检查。2.取样间隔：种子罐每4小时取一次样，发酵罐每8小时取一次样，培养时间在8-12小时后才能做出判定。3.染菌判断连续三个时间的样发生变化，显微镜观察又是同一种菌时，才能判定是染菌。

二、噬菌体的检测噬菌体一般在生产出现异常时，例如突然转稀、糖消耗明显减少，产物合成停止，显微镜观察菌丝减少，菌丝自溶。方法：双层平板琼脂法。三、染菌的处理1、种