鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程

PAGE2PAGE6鳜鱼传染性脾肾坏死病诊断及综合防控技术规程范围本文件规定了鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断、综合防控和记录。本文件适用于鳜鱼传染性脾肾坏死病毒的检测，鳜鱼传染性脾肾坏死病的诊断和综合防控。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件。不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB11607渔业水质标准SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范3术语和定义本文件无术语和定义。4诊断4.1现场调查水质情况包括水源、水色、水温、透明度、pH、亚硝酸盐、氨氮、溶解氧、硬度等；养殖情况包括养殖密度、苗种来源、饵料鱼来源等。4.2临床诊断患病鱼表现为沿池边漫游而死，鳃盖、口腔周围、下颌、胸鳍、腹鳍充血，鳃发白，解剖后肝脏呈现白色或有出血点，肾脏和脾脏肿大或有明显的出血点，部分胆囊肿大，部分幽门盲囊出血（图1）。4.3检测方法4.3.1试剂材料无水乙醇（分析纯）；三氯甲烷（分析纯）；异戊醇（分析纯）；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS；ddH2O；10mmol/LTris-HCl，pH8.0，4℃保存；Tris饱和酚，4℃保存；8U/µLBstDNA聚合酶，-20℃保存；10mmol/LdNTPs混合物（dATP、dTTP、dCTP、dGTP各2.5mmol/L），-20℃保存；10000×SYBRGreenI，-20℃保存；25mmol/LMgCl2，-20℃保存；10×Thermopolbuffer，-20℃保存；甜菜碱，-20℃保存；10×PCRBuffer，-20℃保存；5U/µLTaqDNAPolymerase，-20℃保存；20mg/mL蛋白酶K，-20℃保存；LAMP检测引物序列：F3：5′-AACCACCAGGCAGAAATGG-3′B3：5′-ATCCGAGGCGACGTCATC-3′FIP：5′-TAAAGCCAAAGCCCACATCGGCGAAGACATGGTGCGCTACT-3′BIP：5′-AAGCAAGTGCACAGCACCCGTCAAGCCTCGCACAGAGG-3′巢氏PCR检测引物序列：MCP-F1：5′-ATGTCTGCAATCTCAGGT-3′MCP-R1：5′-TTACAGGATAGGGAAGCCTG-3′MCP-F2：5′-GCGTTTGATGCGATGGAGAC-3′MCP-R2：5′-ACGGCAGAGACACGGTAGGC-3′4.3.2仪器设备灭菌锅；水浴锅；PCR仪；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；凝胶成像系统；离心机。4.3.3采样采集样品的数量参见SC/T7103水生动物产地检疫采样技术规范。鳜鱼体表用75%酒精消毒后解剖剪解剖，无菌操作，剪取小块肾脏、脾脏、肝脏，匀浆后用于DNA提取。4.3.4检测样本模板制备利用酚-氯仿法抽提混合组织DNA。每个样品取组织100mg~200mg，匀浆后置于1.5mL微量离心管，加入含蛋白酶K的裂解液（10mmol/LTris-HCl，pH8.0；1mmol/LEDTA，pH8.0；1%SDS），60℃消化1h~3h。用Tris饱和酚：三氯甲烷：异戊醇（25：24：1）混合液提取、纯化DNA，-20℃冷冻的无水乙醇沉淀DNA，自然干燥，溶于灭菌ddH2O。紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度，X脂糖凝胶电泳检测DNA完整性。DNA样品置于-20℃冰箱保存备用。4.3.5环介导等温扩增（LAMP）检测方法4.3.5.1LAMP扩增按表1加入各项试剂进行LAMP扩增，同时以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，LAMP的反应条件：65℃保持60min，80℃终止反应10min。

表1LAMP反应体系（25μL）试剂体积（µL）DNA模板2内引物（FIP、BIP）各1外引物（F3、B3）各1dNTPs（10mmol/L）2.510×Thermopolbuffer2.5甜菜碱（5mol/L）4MgCl2（25mmol/L）2BstDNA酶（8000U）1ddH2O补足至254.3.5.2LAMP检测结果判断将1μL10000×SYBRGreenI荧光染料加入LAMP反应产物，振荡后观察混合液颜色，绿色为阳性，橙色为阴性（图2）。4.3.6巢式PCR检测方法4.3.6.1PCR扩增按表2加入试剂进行第一轮PCR扩增，同时以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，PCR的反应条件：94℃预变性5min、94℃变性30s、58℃退火30s、72℃延伸1min，循环30次后72℃延伸10min。表2第一轮扩增反应体系（25μL）试剂体积（μL）DNA模板1MCP-F10.5MCP-R10.510×PCRBuffer2.5MgCl2（25mmol/L）2dNTPs（10mmol/L）1TaqDNAPolymerase（5U/µL）0.5ddH2O补足至25按表3加入试剂进行第二轮PCR扩增，以ddH2O为模板作阴性对照，以病毒质粒作阳性对照，PCR的反应条件：94℃预变性2min、94℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸30s、循环30次后72℃延伸10min。

表3第二轮扩增反应体系（25μL）试剂体积（μL）DNA模板（第一轮PCR扩增产物）1MCP-F20.5MCP-R20.510×PCRBuffer2.5MgCl2（25mmol/L）2dNTP（10mmol/L）2TaqDNAPolymerase（5U/µL）0.5ddH2O补足至254.3.6.2巢氏PCR检测结果判断反应结束后，取5μLPCR产物，用1%X脂糖凝胶进行电泳分析，采用凝胶成像系统观察并记录结果，第一轮阳性扩增片段的大小为1362bp，第二轮阳性扩增片段的大小为526bp，阴性无扩增片段（图3）。4.3.7综合判定结合现场调查、临床症状和分子生物学检测结果，诊断结论如下：a）有临床症状，分子诊断阳性的，判定鳜鱼患传染性脾肾坏死病；b）无临床症状，分子诊断阳性的，判定鳜鱼携带传染性脾肾坏死病毒；c）无临床症状，分子诊断阴性的，判定鳜鱼未患传染性脾肾坏死病。5综合防控5.1养殖前准备工作5.1.1养殖用水水源应符合GB11607渔业水质标准。5.1.2池塘准备5.1.2.1池塘清整冬季在捕捞后，排干池水，维修堤埂滩脚，并清除池底过多淤泥及池边杂草，晒池和冻池。5.1.2.2生石灰清塘a）干法清塘：池塘留水6cm9cm，用10kg/100m230kg/100m2生石灰清塘；b）带水清塘：按20kg/100m350kg/100m3生石灰化浆后全池泼洒。5.1.2.3漂白粉清塘漂白粉含有效氯≥28%。a）干法清塘：用量1kg/100m23kg/100m2；b）带水清塘：用量2kg/100m35kg/100m3，先将漂白粉加水溶化后，立即全池泼洒。5.1.3苗种检疫苗种放养前进行传染性脾肾坏死病毒检测。5.1.4疫苗注射鳜鱼苗种下塘前，按照说明书注射国家批准的鳜传染性脾肾坏死病灭活疫苗（NH0618株）。5.1.5苗种放养苗种放养前，先放“试水鱼”，确认安全后，按照生产计划放养。5.2养殖过程管理5.2.1水质调控鳜鱼养殖池塘水体溶解氧宜≥5mg/L，透明度宜≥30cm，pH值宜7.58.5，每隔10d15d，使用生物型底质改良剂和水质改良剂各1次。5.2.2饵料投喂投喂的饵料鱼不携带传染性脾肾坏死病毒，规格不超过鳜鱼全长的50%，投喂前用3%5%食盐水浸泡10min15min消毒。疾病高发期管理水温25℃30℃时为鳜鱼传染性脾肾坏死病发病高峰期，每10d用微生物制剂调节水质进行预防；疾病发生后及时捞除病鱼及死鱼，无害化处理；减少或停止投喂饵料；使用聚维酮碘等药物对水体消毒1次2次，防止交叉感染。6记录详细记录实际防控措施，记录保存2年以上。记录内容应包含苗种及饵料鱼来源、用药量、用药方法、病鱼死亡情况等。实际操作与复核人员需在记录上签字。

附录（资料性）图1鳜鱼传染性脾肾坏死病临床症状图1鳜鱼传染性脾肾坏死病临床症状A：鳃盖、口腔周围、下颌出血；B：鳃丝发白；C：肝脏发白；D：胆囊肿大；E：肾脏肿大；F：脾脏肿大图2鳜鱼传染性脾肾坏死病毒LAMP检测结果图2鳜鱼传染性脾肾坏死病毒LAMP检测结果1：阳性样本；2：阳性对照；3：阴性对照图3鳜鱼传染性脾肾坏死病毒巢氏